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識別和分析T細胞受體

2019-03-05

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学习个体化T细胞治疗中的T细胞受体(TCR)相关知识,包含TCR多样性,TCR库和TCR如何进行表征分析—包括MHC-四聚体方法。

过继性T细胞治疗和TCR

过继性T细胞治疗是一种新的治疗方法,可以形成血液癌病人的长期缓解。T细胞受体(TCR)在过继性T细胞治疗(ACT)中起着重要作用。TCR可以识别肿瘤细胞,把肿瘤细胞作为抗原呈递给细胞毒性T细胞(CTL)。

这可以通过将自然存在的T细胞赋予识别和清除靶细胞的功能或者让自体T细胞通过改造之后表达可以与肿瘤细胞组织相容性抗原(MHC)呈递的肿瘤相关抗原(TAA)或者肿瘤特异性抗原(TSA)具有高亲和力的特异性TCR。靶向病人体内肿瘤细胞的特异性抗原可以被称为高效的个体化癌症治疗。

本文主要通过对过继性T细胞治疗(ACT)中T细胞受体(TCR)的分析,来认识T细胞受体库的重要性和如何进行T细胞受体表征分析。

T细胞受体多样性

我们的免疫系统中拥有超过3千亿个T细胞和超过3亿种T细胞受体(TCR)。T细胞功能的发挥依赖于TCR信号。抗原诱导的TCR活化可以激活下游信号通路。这些通路的激活可以造成T细胞增殖,活化和细胞因子的产生,比如干扰素g,白介素2和颗粒酶B,所有这些对于表达特异性抗原的肿瘤细胞的杀伤都起到关键作用。

TCR是一种高度多样的异二聚体,主要有α和β链或者γ和δ链构成。每一种TCR都是通过抗原识别位点对特异的抗原识别。

这样的TCR结构主要来源于V(D)J重排— TCRα和δ链的可变区是由多个V(Variable)基因和J(Joining)基因重排组成,TCRβ 和 γ链的可变区除了多个V基因和J基因的重排之外还有多个D(Diversity)基因参与重排。

当TCR完成重排之后,α和β链可以与抗原呈递细胞(APC)上的多肽组织相容性抗原(pMHC)结合。

TCR库在有效杀死肿瘤细胞中的重要性

TCR库被定义为在单一个体体内所有T细胞表达的TCR。TCR库是动态的,并且在癌症,自身免疫性疾病,炎症和感染等的发生和发展中会有很大变化。

在肿瘤中,CTL可以通过识别TAA和TSA有效杀死肿瘤细胞。通过对肿瘤浸润淋巴细胞库的分析,可以将这些参与特异有效的杀死肿瘤细胞的细胞群鉴别出来。

主要挑战在于如何在大量的免疫细胞中富集这些细胞并分析其多样性。

TCR表征和TCR库分析

目前的免疫治疗生物制剂只能对少于30%的病人有效。在这些对免疫检查点抑制剂有效的病人中,一致的地方在于这些病人拥有更广泛的和更多扩增的肿瘤特异性T细胞克隆。所以,目前的研究热点和挑战就是在于学习对于免疫治疗有疗效的病人和没有疗效的病人的T细胞库。

为什么TCR表征分析如此重要?

T细胞的特异性是通过每个T细胞的特异性的TCR介导的。每个个体都存在很大多样性的识别和清除特异性抗原的TCR。通过对组织样本的T细胞多样性的测量,可以对跟踪病人对肿瘤特异性抗原的反应提供有用信息,从而得到有效治疗。

对于免疫治疗和T细胞治疗,追踪不同时间段的在病人不同组织中的针对肿瘤特异性抗原的T细胞的反应性很关键。

目前分析TCR库有多种方法存在,但是还没有一种方法是标准方法或最好的方法。具体使用哪种方法取决于个人倾向,具体目的和可提供的技术。

测序方式是最早被采用并且目前被广泛使用的技术之一,因为这项技术易于和研究机构建立基于DNA/RNA样本的外包服务。然而,还有一些其他新的技术。

使用基于5’RACE(cDNA末端快速扩增)的下一代测序进行TCR分析

有一些商业公司提供了TCR分析服务(比如SMART®),使用基因组DNA或RNA作为分析原料。这项服务可以进行大规模分析或者可以在单次实验中分析单个细胞的数百万个TCR。

虽然这项技术可以产生高通量的数据,但需要加入大量的核酸(每对引物需要50-100ng),成本较高。另外一个挑战在于基于预测的抗原特异性整合不同组的TCR序列。

在TCR分析中使用MHC四聚体技术的优势

只有当抗原多肽结合在细胞表面的组织相容性复合物(pMHC)相应凹槽时,TCR才会进行识别。TCR-pMHC相互作用可以指导T细胞选择性扩增,然后成熟为具有功能的T细胞。

由于pMHC单体和TCR的结合力较低,pMHC四聚物技术得以发展,四聚物对TCR的结合力是单体的100倍。这就提供了一项深入学习TCR库的技术。pMHC四聚体是由四个分别结合有特异性抗原多肽和相应荧光基团标记的MHC单体构成。

荧光素标记的MHC多肽四聚体

现在有很多荧光素标记的pMHC四聚体可供选择。这就允许了单细胞表型分析,使得利用最多可达17色通道的流式细胞仪同时分析不同T细胞亚群成为可能。

这项技术可以通过流式细胞分选,获得目标T细胞群,还可以继续进行细胞培养或下游分析。而之前所述的测序技术则无法再进行下游进一步的样本分析。

目前使用荧光素标记的pMHC四聚体的限制是为了选择合适的四聚体,我们需要了解哪些pMHC四聚体对哪些TCR是特异性的。

DNA标签MHC多肽四聚体

最近的创新是把MHC四聚体标记上DNA序列的标签。带有DNA标签的四聚体可以通过后续的PCR扩增和测序得到相应的特异性的四聚体信息。

这项技术可以对肿瘤特异性的CD8+ T细胞进行鉴定,分离,定量和测序。DNA标签技术可以跨越目前同时使用数百种pMHC四聚体分析T细胞库和TCR所面临的障碍。

另外,通过结合TCR的深度测序的技术进步使得同时对大量的T细胞进行TCR测序成为可能。所以,研究者既可以从T细胞库中分离得到多肽特异性T细胞,也可以通过pMHC四聚体技术得到的单个T细胞进行单细胞TCR测序分析。

这样的技术平台可以针对大量的细胞或单个细胞进行分析。可以让分离在肿瘤抗原刺激的CTL介导的肿瘤细胞杀伤过程中参与的特异性T细胞的鉴定变得更加简单。

通过DNA标签MHC四聚体鉴定单个T细胞的TCR和其多肽结合特异性
Identification of Single T Cell Populations by Barcoded pMHC Tetramers

总结

TCR分析是对免疫治疗以后负责肿瘤细胞清除的特异性T细胞克隆的鉴定的关键。最新的MHC四聚体技术使得TCR表征分析变得更加简单。这原本是一个很有挑战性的工作,因为每个T细胞都有自己的独特的TCR序列以识别不同的结合了多肽抗原的MHC。通过对TCR的表征分析,我们可以鉴定出这些T细胞靶向的特异性抗原。

MHC四聚体使得研究者们学习或辨认出对免疫治疗有疗效或没有疗效的病人的肿瘤特异性T细胞的不同。这项技术可以鉴定出对肿瘤清除起到关键作用的T细胞克隆和相应的表位(或者全新的表位)。通过这些信息,我们可以很大程度上提高下游的癌症疫苗或者T细胞治疗的设计。

Topics: Oncology

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