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非酒精性脂肪性肝炎的饮食小鼠模型:改良AMLN饲料诱导模型与MSNASH小鼠模型的比较

2020-02-03

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比较非酒精性脂肪性肝炎(NASH;包括AMLN和GAN饲料诱导的疾病)饮食诱导小鼠模型与下一代多基因模型的关键特征。

临床前NASH饮食小鼠模型的建立

NASH药物临床前开发中面临的主要挑战是目前小动物模型的适用性。理想的疾病表现将具有人类NASH的多个特征,包括代谢症状和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的先兆。进食西方饮食饲料中的有害成分可诱发疾病。

早期NASH模型开发的重点是为动物提供过量的热量密度(脂肪形式),以及提供大量的精制糖(特别是果糖)。这些饮食在小鼠中重现了NAFLD样疾病,但涉及一种多月方案,并且仅达到了轻度至中度的NASH样纤维化。同时努力引入了炎症化学损伤和/或微量营养素限制以加剧纤维化,但这些操作损害了纯代谢性疾病背景下的可转化性。

NASH饮食小鼠模型的动物选择

C57Bl/6(“B6”)谱系小鼠是早期临床前研究的主要模型,包括肥胖和代谢性疾病的饮食模型。常用的亚系包括原始Jackson Laboratory小鼠(B6J)和NIH亚系(B6N)。这些亚系的不同点在于影响体重增加、胰岛素抵抗、氧化应激敏感性等的各种遗传性变型。

根据历史经验,B6J小鼠是使用最广泛的品系。目前,Taconic Biosciences品系B6N小鼠(“B6NTac”)在肥胖、代谢综合征、NAFLD和NASH模型中越来越受欢迎。该亚系的脂肪体重增加、胰岛素分泌和对B6J的胰岛素抵抗均明显更高,甚至在这些方面还优于B6N祖先谱系。

自从肥胖流行症出现以后,在野生型B6小鼠中寻找NASH的高转化模型一直是代谢研究界的追求。近年来,营养科学和畜牧业的突破显著推进了临床前NASH模型的建立,并提供了有吸引力的商业选择,包括通过AMLN和GAN饲料诱导的疾病模型,以及下一代多基因模型。

AMLN饲料

2012年,Amylin Pharmaceuticals的研究人员引入了一种新型肥胖和纤维化小鼠NASH饮食模型 。该模型允许动物自由进食Research Diets Inc.生产的饲料配方D09100301,配方组成如下:

  • 40%千卡脂肪(主要为Primex氢化植物油起酥油,即反式脂肪)
  • 20%千卡果糖
  • 2% w/w胆固醇

该配方通常被称为AMLN(Amylin Liver NASH)饲料

进食AMLN饲料的B6J小鼠在12周内出现了快速、稳健的体重增加,大约是标准饲料组(10%脂肪,无果糖或胆固醇)的3倍。这一体重增加倾向于脂肪堆积。

AMLN小鼠出现肝肿大,肝脏达到总体重的8%左右,而标准饲料对照组为4%。12周内循环肝损伤指数(氨基酸转氨酶)显著升高。进食AMLN饲料引起的脂肪变性可归因于D09100301的反式脂肪成分,因为接受等效方案替代饱和猪油脂肪的小鼠在疾病特征谱方面表现出更轻微的症状。

在AMLN饲料组中,16周内NASH的组织病理学变化不显著且变异性较高,而在30周后的变化则较频繁且为明显的轻至中度。肝脏特征包括:

  • 大泡性和微泡性脂质蓄积
  • 炎症浸润
  • 胶原沉积增强
  • 部位纤维化,包括门静脉周和窦周。

除达到明显NASH所需的时间(26-30周)外,异质性也是一个混淆问题。在B6J小鼠中,临床NAFLD活动性评分(NAS)参数表现出各种疾病严重程度。这包括仅在动物亚群中存在的肝细胞气球样变。这种变异性非常显著,足以导致将个体动物分入严重程度队列。这一具有挑战性的壮举最好通过侵入性活检来实现,而后者是一种昂贵且具有技术挑战性的检测方法,大多数研究人员都无法实现。

针对进食AMLN 30周的B6J和B6N小鼠的亚系间差异的探索发现了一些表型差异,包括体重增加(B6J < B6N)、肝脏甘油三酯含量(B6J > B6N)和肝损伤的血清生物标志物(B6J < B6N)。NAFLD和纤维化的临床评分在幅度和变异性方面大致相同,因此没有通过NIH亚系选择的快速解决方案。

GAN饲料

近期FDA关于反式脂肪作为食品添加剂的禁令促使了改良AMLN饲料的开发,其中含有Primex的合适有害替代脂肪。继而开发出了Research Diets Inc.饲料配方D09100310,配方组成如下:

  • 40%千卡脂肪(主要为棕榈油)
  • 20%千卡果糖
  • 2% w/w胆固醇。

这种饲料通常被称为GAN(Gubra Amylin NASH)饲料

与AMLN相比,进食GAN的B6J小鼠出现的体重增加幅度甚至更高。另外,对接受28周GAN和AMLN饲料的B6J小鼠进行了一次头对头比较,结果显示两饲料组动物的脂肪变性同样显著,NAS评分和纤维化程度相当。但是,NAS评分和纤维化蓄积的异质性仍然是同等混杂因素,个体动物表现出明显不同的分期。因此,补充棕榈油完全补偿了GAN饲料中的反式脂肪,但并未解决模型的局限性问题。

在Taconic Biosciences内部,目前正在努力描绘进食GAN饲料的B6NTac小鼠的特征。早期结果提示良好前景,证实肝病的关键阶段发生在反映B6J和B6N小鼠历史特征的时间点。这包括第12周出现的脂肪变性、第20周出现的炎症和第26周出现的纤维化。

该小鼠谱系是否存在异质性问题仍有待观察。但是,如果使用该品系解决了这些问题,本组织的目标是提供符合购买方肝病项目理想起始点的现成动物,通过绕过漫长的饮食诱导期,从而促使快速启动项目。

MS-NASH小鼠

这种新型多基因小鼠品系正逐渐成为代谢和肝脏疾病研究的首选。MS-NASH小鼠可从Crown Bioscience和Jackson Laboratory获取,该品系小鼠是通过B6J与AKR/J品系的初始杂交产生的。30代以上的选择性近交产生了一种自发肥胖、胰岛素抵抗和高血糖的小鼠品系,该品系小鼠在高脂饮食(60%千卡脂肪)中能够更快速、更严重地触发这些代谢表型。

MS-NASH小鼠 在进食含果糖的西方饮食饲料的短短20周内,通过代谢失调、肥胖和脂肪变性迅速进展为NASH,配方组成如下:

  • 41%千卡脂肪(主要为黄油)
  • 29%千卡蔗糖
  • 0.21%胆固醇w/w
  • 5%果糖(w/vol),置饮用水中,自由摄入

进食后8周内,肝损伤标志物升高,NAFLD参数可能最短在16周内获得具有临床意义的评分,20周内出现纤维化。

鉴于在转化相关饮食中的诱导时间较短、代谢紊乱的多基因基础以及广泛的商业可用性,MS-NASH小鼠预示着临床前NASH研究的下一个重大突破。

AMLN-GAN饲料诱导模型vs. MS-NASH小鼠模型:头对头比较

小鼠品系 C57Bl/6 (J, N, NTac) MS-NASH
肥胖的多基因易感性
饲料 AMLN: Research Diets D09100301
GAN: Research Diets D09100310
Research Diets D12079B与果糖(置饮用水中)
脂肪 40%千卡

AMLN:主要为Primex反式脂肪

GAN:主要为棕榈油
41%千
卡
主要为黄油
果糖 20%千卡 29%千卡,置饲料中(蔗糖)

5% w/v,置饮用水中
胆固醇 2% w/w 0.21% w/w
开始进食时的年龄 6-10周 6-10周
循环肝损伤标志物 12周 8周
循环肝损伤标志物 12周 12周
NAFLD 20周 16周
纤维化 26周 20周
动物间变异性 AMLN: 是
GAN: 研究正在进行中

上表直接比较了AMLN和GAN饲料诱导的MS-NASH小鼠和NASH模型。与AMLN饲料诱导的单基因模型相比,多基因MS-NASH小鼠中的动物间变异性更低(GAN饲料研究正在进行中)。与AMLN/GAN饲料诱导模型相比,MS-NASH小鼠在短时间范围内的疾病特征也均很明显,包括NAFLD、纤维化和循环损伤标志物的证据。

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