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第二代测序 101

2020-07-20

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了解当下第二代测序技术的应用范围,包括全基因组、RNA和全外显子组测序。

第二代测序技术在了解疾病中的应用

通过对个人基因组中的信息进行分析,人们对疾病进展和治疗反应中的个体差异有了更全面深入的理解。基于以上的知识和理解,现在已经可以根据每个人独特的遗传(及分子)信息来制定个体化的医疗策略,来预防、诊断和治疗疾病。因此,能够对一个人的基因组(全部或部分)进行测序是个体化医疗的第一步。

第一个商业化的DNA测序方法是Sanger测序法。Sanger测序法主要包括三个步骤:

  1. 链终止PCR反应(聚合酶链式反应)。
  2. 通过凝胶电泳来分离扩增出到的DNA片段。
  3. 通过数据分析来确定DNA序列。

人们曾花费13年时间和27亿美元来用Sanger测序法对人类基因组进行测序。

为了加快测序进程,人们开发出了利用化学反应和多种光学检测手段对多个DNA片段进行平行测序的新技术。这些技术称为下一代测序(NGS)或者第二代测序技术,它们大大缩减了全基因组测序所需的时间和金钱。现如今,对全基因组测序仅需数小时时间和不到1000美元的花费。

第二代测序技术

NGS是各种现代的高通量DNA和RNA测序技术的统称,它比桑格法更快更便宜。NGS的出现推动了分子生物学、基因组学甚至肿瘤学等其他疾病相关学科的进步。

目前有几种商用的NGS平台。现在主导市场的是Illumina(因美纳)。根据需求的不同,Illumina可以提供多种平台,包括针对小型基因组的可以当日就出测序结果的MiSeq。Thermo Fisher Scientific(赛默飞世尔)的Ion Torrent或Ion Proton平台可以通过探测pH(酸碱度)差异来进行测序。Pacific Biosciences的平台利用带有单个DNA分子的芯片进的单分子实时技术进行测序。零模波导技术通过探测带荧光标记的单个核苷酸与DNA聚合酶的结合时的荧光信号来测序。这项技术能够提供平均长度超过10000碱基对的读数。

全基因组测序

顾名思义,WGS是指对全基因组测序。这包括了染色体和线粒体DNA(在植物中为叶绿体DNA)。WGS也可以对微生物进行基因组测序。WGS的有点有:

  • WGS是所有NGS实验方法中分辨率最高的。
  • 能够检测到靶向测序方法中可能会遗漏掉的大大小小的变异。
  • 能够识别到非编码区的可能与疾病相关的变异。
  • 对新基因组的测序和组装。

在现今的NGS技术中,WGS仍然是最昂贵的,尽管也是相对能够接受的。由于需要覆盖全基因组,WGS也需要最长的测序时间(相比其他NGS技术)。

RNA测序

RNA测序是对样品中转录组(转录的总RNA包括信使RNA、核糖体RNA和转移RNA)的数量和序列进行分析。通过对转录组的研究,我们可以知道样品中的基因表达水平以及他们在什么时间什么部位被激活或抑制。RNA测序能够捕捉到选择性剪切的相关信息,而这些是无法被DNA测序所检测到的。RNA测序还能够识别某些特定的转录后修饰,比如聚腺苷酸化和5端加帽。利用RNA测序技术可以进行SNP(单核苷酸多态性)的识别和分析,转录谱分析,RNA编辑和基因的差异化表达分析。

典型的RNA测序的实验方法有4步:

  1. RNA的提取和纯化。
  2. cDNA文库的构建。将提取的RNA反转录成cDNA可以获得NGS技术所需要的衔接子。
  3. cDNA文库的测序。有多种的测序平台和方案可以选择。单端测序只能从cDNA的一端开始测序,而双端测序可以用从cDNA的两端同时测序。这使得单端测序比双端测序更便宜更快速。除这些以外,还有链特异性和非链特异性的实验方法。特异性链方法确定了RNA是从哪条DNA单链转录过来的。
  4. 数据分析。测序结束后会有数以百万计的片段生成。软件会把这些片段与参考基因组进行比对,从而生成RNA序列图。目前有很多不同的软件和方法可用于RNA测序结果的分析。

全外显子组测序

外显子组测序或者全外显子组测序(WES)仅对被称为外显子的蛋白质编码区进行测序。尽管人类的外显子组仅占人类全基因组的3%,但是有大约85%的疾病相关的突变都发生在外显子组内。

相比于WGS,WES有如下的优点:

  1. WES只关注基因组里的编码区而非整个基因组。
  2. 如果您在研究编码区序列(单核苷酸变异、插入缺失标记等)的变化,那么WES相比于WGS在经济上更为划算。
  3. 相较于WGS的数据量(大约90GB),WES的数据量跟小(4-5GB),这样更易于处理和分析。
  4. 更快的测序时间。在给定的测序深度下,整个外显子组可以在仅仅数分钟内完成测序。

第三代测序技术

第三代测序(TGS)平台尝试弃用当下第二代测序平台使用的扩增步骤。TGS平台有望通过利用DNA的物理特性来进行单细胞测序。Oxford Nanopore(牛津纳米孔)是当下行业内将该技术商用化最成熟的领头公司之一。Oxford Nanopore开发的MiniION可以通过USB设备在台式计算机上进行测序。Oxford Nanopore开发的技术原理是,DNA(核苷酸)从蛋白质纳米孔膜中穿过引起离子流(电流)的变化,通过对离子流(电流)变化的监控来进行测序。

Topics: Blog, Oncology

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