比较两种广泛使用的转录组学技术（全基因组RNAseq和基于阵列的NanoString）的优缺点。
肿瘤中转录组学的兴起
近年来，精准肿瘤诊疗模式迅速发展，部分是由于技术创新和对个体化治疗的兴趣增加所致。精准医学诊疗模式依赖于生物标志物来确定最佳治疗策略，在疾病诊断、疗效评估和/或疾病进展中发挥着重要作用。
基因表达研究是一种识别生物标志物的有用工具，这些生物标志物用于诊断癌症和预测疗效和疾病预后。近期，高通量技术呈爆发式出现，这些技术产生了大规模的分子测量结果，加快了基因表达生物标志物的发展。尤其，转录组学是一种用于发现生物标志物的强有力方法，因为它描绘了一个基因组产生的全部RNA转录本。
这篇文章将帮助您为您的mRNA分析研究选择正确的转录组学技术。它重点介绍了RNAseq和NanoString平台的主要步骤和优缺点，并简要回顾了其他可用的技术。
RNA测序(RNAseq)
RNA测序，通常称为RNAseq，直接对整个转录组中mRNA分子的数量进行排序和量化。这项技术具有广泛的应用，包括识别与特定疾病状态相关的基因表达变化。例如，通过识别不同样本中表达的变异，以RNAseq分析癌症提供了关于肿瘤分类和进展的关键性见解。
RNAseq的主要步骤
RNAseq具有四个主要步骤，包括：
- mRNA转录本片段化，然后随机引物结合至mRNA片段
- 通过mRNA片段的逆转录从第一链和第二链cDNA合成生成双链DNA
- 通过磷酸基和Poly(A)尾标记片段末端
- 连接衔接子至cDNA片段上，实现下游PCR扩增和测序。
了解RNAseq的主要优缺点是很关键的，从而确定它是否是您的特定研究所需要的最佳测定技术，这一点很关键。
RNAseq的优点
- 与传统基于杂交的技术（如阵列）不同，RNAseq无需使用特定的探针（如物种或转录体特异性探针）。这使得它成为一种强大的工具，用于检测新转录本、基因融合、单核苷酸变异、InDel（小插入和缺失）和其他阵列无法检测的变化。
- 全基因组分析技术可对人类基因组中约26000个基因进行评估，使其成为一种用于发现生物标志物的强大工具。
- RNAseq具有较高的灵敏度，可通过简单地增加测序覆盖的深度来检测稀有和低丰度的转录本（如弱表达基因和细胞中的单个转录本）。
- 它能够发现新的复杂基因组特征，如以前未知的转录特征，包括选择性剪接、等位基因特异性表达和新转录区域。
RNAseq的缺点
- 需要高质量的RNA，建议的RNA完整指数为高于8。
- RNAseq还需要至少1 µg总RNA，但最好≥2 µg，与NanoString相比需要更大的样本量。
- 完全去除基因组DNA是关键。因此，有必要进行DNase处理，因为无法区分扩增的RNA与基因组DNA。
- 下游分析需要由经验丰富的科学家进行，以便充分利用这些信息。为获得标准化基因表达所进行的原始数据处理的成本较高
NanoString
NanoString Technologies, Inc.开发了一种名为“nCounter”的技术，它是DNA微阵列的一种变体，具有稳健、灵敏、可重现、易于使用且无需扩增的特点。NanoString平台对单个mRNA转录本进行计数。它对许多潜在应用都很有用，如研究基因调控途径、诊断、验证包括癌症在内的疾病研究中的基因表达实验以及最终生成用于临床的高度可译性数据。
使用NanoString平台的主要步骤
NanoString针对每个mRNA分子使用两个杂交探针（每个探针的长度约为35-50个碱基长度）。针对每个独特区基因生成探针对。报告探针携带信号。另一个探针“捕获”复合物。通过对其进行固定，数字分析仪可检测杂交报告探针（存在四种不同颜色的荧光团)。将探针与溶液中的RNA混合。数字分析仪对每个样本的分子条形码进行识别、扫描和计数。值得注意的是，由于探针直接重组至RNA，因此无需逆转录步骤即可生成cDNA。
NanoString的优点
- 无需高质量的RNA。因此，它是仅存在低质量RNA可用情形下的理想技术，包括福尔马林固定石蜡包埋物料。
- 与RNAseq相比，需要的起始物料量更少：从10,000个细胞中提取100 ng总RNA或裂解物。
- 背景信号微小。
- 无扩增。
- 出现引入偏差的可能性较低。
- NanoString平台已改善对低表达RNA的检测。
- NanoString Technologies免费提供数据分析软件，其读数为用户友好型，适合非专业人士使用。
NanoString的缺点
- 它不适用于发现生物标志物，因为它使用了约800个基于出版物的预选择基因。
- 它是一个灵活性较低的专有平台。
比较Illumina MiSeq RNAseq、NanoString nCounter和DNA微阵列的分析属性
改编自Narrandes和Xu，Gene Expression Detection Assay for Cancer Clinical Use，J Cancer，2018年；9(13):2249-2265。
| Illumina MiSeq RNAseq | NanoString nCounter | DNA微阵列 | |
|---|---|---|---|
| 引物/探针设计 | 流动细胞上的引物和衔接子，连接至样本末端 | 带有3’亲和标记物的捕获探针和带有彩色编码的报告探针 | DNA寡核苷酸探针，与DNA样本互补 |
| 样本制备 | RNA提取；逆转录样本；片段化、库建设 | RNA提取 | RNA提取；逆转录样本；片段化 |
| 仪器 | MiSeq台式测序仪 | 制备站和数字分析仪 | 微阵列扫描仪 |
| 可复制 | 是 | 是 | 是 |
| 特异性 | 依靠数据分析 | 捕获和报告探针的设计 | 重组至切片的探针密度、探针设计 |
| 灵敏度 | <1拷贝/细胞 | <1拷贝/细胞 | 1–10拷贝/细胞 |
| 临床应用？ | 是 | 是 | 是 |
| 针对临床应用的商业化 | 否 | Prosigna (NanoString Technologies, Inc.) | MammaPrint |
| 所检测基因或转录本的数量 | 整个转录组 | ~800 | 50,000 |
| 每次测定的最高样本量 | 96 | 12 | 1-12/阵列 |
| 处理步骤 | cDNA库建设、 测序、 数据分析 |
标记探针、 杂交至阵列、 数据分析 |
标记cDNAs、 杂交至阵列、 数据分析 |
| 原始数据分析 | 在3小时内由机器进行 | 在2.7小时内由机器进行 | 在1小时40分钟内由机器进行 |
| 标准化 | 每百万读段数中每千碱基长度的读段数 | 管家基因；阳性对照物 | 管家基因；稳健的多阵列平均值；LOWESS法 |
| 数据分析 | 数据输出为具有质量分数或读对齐的序列读段数 | 采用并输出彩色编码图像为代码计数 | 可视化；统计检测 |
其他可用的mRNA分析平台
存在其他一些测序方法可用于mRNA分析，在这里进行了简要总结，包括一些可用商品的列表。
3’RNA测序：
在这里，mRNA在逆转录之前未片段化，而cDNA仅从mRNA的3 ‘末端进行逆转录。因此，针对每个转录本仅生成一个cDNA拷贝。这意味着当cDNAs被测序后，读段数直接反映了特定基因的转录本数量。
商用产品：Lexogen QuantSeq、QioSeq UPX 3’转录组
特定靶向测序：
这种方法针对的是RNA序列，通过杂交至DNA寡核苷酸，然后去除未杂交的寡核苷酸，并扩增剩余产物。
商用产品：BioSpyder TempO-Seq、Ion Ampliseq转录组
传统微阵列：
通过将RNA杂交至一个互补探针阵列（通常对应于基因的3 ‘末端），这些阵列被用于量化一组已定义的转录本。这项技术可用于同时评价成数千个转录本。荧光检测的进步提高了准确检测低丰度转录本的能力。
商用产品：Affymetrix U133A、Illlumina BeadChip HT-12 v3/v4
较新微阵列：
这些阵列聚焦于20,000多个注释良好的基因，并提供了转录组的基因水平视图。这些较新阵列由已定义的探针组构成，针对特性外显子而非基因的3 ‘末端进行寻靶。
商用产品：Affymetrix Clariom S
结论
不同的测量平台均可可靠地生成转录组学数据。本文总结了RNAseq和NanoString基因表达分析平台的相关优缺点。最终，对所使用平台的选择将取决于研究终点、所需分录度和覆盖率、通量、样本质量、可用性和预算。
