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比较指南:四氯化碳诱导和胆碱缺乏饮食模型

2020-03-14

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比较常用的加速NAFLD和NASH(含纤维化)商业小鼠模型的关键特征,例如四氯化碳诱导和饮食中胆碱和蛋氨酸缺乏,以及新一代胆碱缺乏模型。

开发临床前NASH纤维化模型

NASH纤维化受多个机械学枢椎驱动,而一些快速的传统啮齿动物模型可作用于这些枢椎上。这一机制提供了一系列可证明适用于某些候选药物的快速模型:

  1. 使用四氯化碳进行炎症、脂肪变性和细胞死亡的毒素诱导
  2. 通过饮食中胆碱和蛋氨酸缺乏诱导的肝脂肪变性
  3. 增强NASH的新一代胆碱缺乏模型,没有早期模型中观察到的重度体重减轻

这篇贴子比较了这些传统纤维化模型,探讨了它们在纤维化和NASH药物开发方面的优势和局限性。

[在此添加表格]表格标题:四氯化碳诱导模型相对胆碱缺乏饮食模型

 
CCl4
MCD
CDAA
CDAHFD饮食
CCDF
模式 化学毒性 营养缺乏 营养缺乏 营养缺乏且高脂肪热量 营养缺乏且高脂肪热量
机制 脂肪代谢和高尔基体功能受损导致脂肪堆积;炎症和一般毒性导致细胞死亡和瘢痕形成 通过VLDL损害肝脏甘油三酸酯分泌 通过VLDL损害肝脏甘油三酸酯分泌 通过VLDL损害肝脏甘油三酸酯分泌 通过VLDL损害肝脏甘油三酸酯分泌
体重变化 中性或轻度减轻 重度减轻 轻度减轻至轻度增重 轻度增重 轻度增重
高脂血症 无至轻度
高血糖症 低血糖症
肝脂肪变性
血清ALT和AST 中度 中度 轻度
肝纤维化 重度 小鼠:重度
大鼠:无至轻度
重度 重度
纤维化诱导持续时间 小鼠:4-8周
大鼠:8周
小鼠:4周 小鼠:20周
大鼠:8-12周
6-8周 6-9周
给药后纤维化可逆性 中度 不适用

四氯化碳NASH纤维化模型

溶剂四氯化碳(CCl4)是一种毒素,通过肝脏细胞色素P450代谢为三氯甲基自由基(–CCl3)。这会与许多肝脏靶标发生反应,达到多种类似NASH的效应

  • 线粒体活性氧簇引发的炎症
  • 脂代谢酶活性降低和高尔基氏体驱动的VLDL分泌受损导致的脂肪变性
  • 广泛的细胞损伤,导致细胞死亡和纤维化

这些有害效应在没有肥胖或胰岛素抵抗的情况下发生,并且涉及大量与脂质贮积和代谢无关的细胞死亡。因此,这并不代表真实的NAFLD。但是,CCl4模型具有三个关键优势。

首先是执行起来非常简单,通常需要每周两次腹膜内注射CCl4,持续四到六周,具体取决于小鼠品系的敏感度。常用且经济实惠的实验室品系BALB/c, C57BL/6, 和DBA/2已经过充分证明,具有高到中度敏感度。Sprague DawleyWistar等常用大鼠品系也适用。

其次,该模型展示了人类疾病的许多组织学特征。这包括进行性纤维化,从中心周围区域进展到重度桥接纤维化,然后是肝细胞癌。肝脏转氨酶(ALT、AST)泄漏为肝脏疾病进展提供了易于量化的循环生物标志物,而细胞因子TNFα和IL6是炎症的标志物。该疾病的严重程度存在剂量依赖性,如果采用次优治疗方案,纤维化可能会自发逆转,从而可能会混淆NASH逆转供试品的疗效。总体而言,CCl4模型是一个特征明确的系统,用于从可预测的严重程度开始评价NASH治疗的疗效。

最后,CCl4的肝脏毒性涉及许多机制,这些机制是致力于治疗NASH的药物开发的靶标。这些靶标包括诱导细胞凋亡的NLRP3炎性小体转化生长因子β的促纤维化活性。值得注意的是,CCl4抑制了法尼基衍生物X受体(FXR)的表达。使用奥贝胆酸(OCA)进行FXR活性药理学抢救在该模型中显示出保护作用;人们普遍预期OCA将于今年晚些时候成为获得FDA批准的首个NASH药物

除了缺乏对人NAFLD/NASH的真正可译性外,该模型的主要缺点是影响非肝脏器官和组织的全身毒性。CCl4的另一个挑战是对技术人员的潜在化学危害。该模型只能由训练有素的操作人员执行,并要配有适当的防护设备和化学安全基础设施。

胆碱缺乏饮食NASH纤维化模型

在数代啮齿动物饮食NASH模型中都利用了胆碱缺乏。胆碱和蛋氨酸是肝线粒体β氧化和极低密度脂蛋白(VLDL)合成所需的关键营养素。喂食蛋氨酸/胆碱缺乏(MCD)饮食时,甘油三酸酯的输出受到抑制,从而迅速诱导肝脂肪变性和炎症。

像CCl4一样,MCD饮食因其易用性和快速诱导而广受欢迎。 两周内血清ALT/AST稳健上升,并且临床NAFLD活性评分在同一时间段内接近最大值。纤维化也迅速发生,在短短4周内就很明显,10周内达到重度。在不超过16周的时间过程中,纤维化是可逆的,因此应在更长的时间范围内运行模型,以评价可改善NASH的药物。但是,动物选择比CCl4模型受到更多限制。C57Bl/6小鼠是首选的易感小鼠品系;大鼠会进展为稳健的脂肪变性,但只有轻微炎症,且没有纤维化。

MCD模型有许多转译和实践方面的缺点。最明显的是,动物经历了快速而严重的体重减轻(从饮食开始超过40%),以及血清葡萄糖甘油三酸酯和胆固醇降低。体重减轻程度造成了福利影响,并给操作人员带来了动物处置和给药方面的挑战,而代谢表型则与人类状况直接相反。模型的转录组学改变也被批评为对人类NAFLD代表性不佳

第二代胆碱缺乏饮食

经证明,第二代胆碱缺乏饮食可在啮齿动物中诱导NAFLD/NASH,而不会导致MCD饮食重度体重减轻。胆碱缺乏性左旋氨基酸(CDAA)饮食可以用精确等量的左旋氨基酸代替蛋白质含量。虽然首字母缩略词中没有表示,但CDAA饮食的蛋氨酸也有所减少(但没有去除)。接受CDAA的C57Bl/6和BALB/c小鼠在3周内出现脂肪变性和炎症。纤维化发生在第6周,并在第21周左右变为轻度至中度,这也是可逆的。

这种饮食也适合在WistarFisher大鼠中诱导NAFLD/NASH,并且与小鼠的疾病发作和进展时间范围相近。尽管任何啮齿动物体重减轻都不是该模型的缺点,但是该模型中不存在NAFLD之前的人类代谢表型(胰岛素抵抗、高血糖症、脂血症等)。

CDAA的热量脂肪含量从10-20%丰富至60%(胆碱缺乏性左旋氨基酸高脂饮食;CDAHFD)会加速并加重NASH,并显著降低纤维化的自发可逆性。这种修饰非常适合评价NASH治疗中的纤维素溶解剂。在C57Bl/6小鼠中,该模型还将在24周内发展为肝硬化、门静脉高压和肝功能衰竭,因此对于肝脏疾病研究项目而言具有相当多用途。然而,在碱缺乏饮食的这种迭代中,没有肥胖、高血糖症和高甘油三酯血症等代谢综合征的特征。

CDAHFD的最后一个变化是添加胆固醇的新型胆碱缺乏纤维化(CCDF)饮食,产生了更严重的肝损伤和肝纤维化而没有重度体重减轻。游离胆固醇具有刺激炎症反应、增加肝细胞死亡和纤维化的毒性。CCDF中含有临床相关量的胆固醇(按重量计约1%)。Wistar大鼠和C57BL/6小鼠的数据表明,CCDF饮食提供了一个宝贵的平台,可在短短6-8周内诱导肝脂肪变性和纤维化,并在高脂饮食下产生了少数NASH/纤维化大鼠模型之一。

传统啮齿动物模型的局限性

一般而言,这些模型的可译性是一个主要警告事项,也是NASH药物临床前开发的一大挑战。早期的一篇博客帖子探讨了结合西方人群不良饮食习惯的饮食,并向具有代谢疾病敏感性或多基因易感性的动物投喂。就体现人类疾病而言,当前这一代模型为同类最佳,但需要较长的诱导时间才能达到终点,并且存在较高的动物间变异性。

结论

经典的CCl4肝脏毒性模型以及胆碱缺乏诱导的脂肪变性的多次迭代,为NASH和肝纤维化提供了一套特征明确且广泛可用的啮齿动物模型。在选择四氯化碳诱导或胆碱缺乏饮食模型时,应结合它们的优点,同时必须考虑其在人体条件下可译性方面的诸多局限性。本文总结的所有模型均未呈现通常在人类脂肪肝疾病之前出现的代谢综合征的特征。

但是,在适当的科学背景下,它们可用于对NASH治疗剂进行快速相关的临床前表征,并且可能是使用较慢但更易转译的同类最佳模型(涉及西化饮食和具有肝病多基因易感性的啮齿动物品系)的合理替代选择。

Topics: Blog, CVMD

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