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博客

癌细胞系鉴定

2020-04-02

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回顾癌细胞系鉴定的最佳实践,包括STR和SNP检测的比较。

鉴定癌细胞系的重要性

临床前癌症研究模型——如人异种移植瘤、鼠同种移植瘤、人和鼠细胞系以及类器官——广泛用于癌症研究和药物研发。由于这些模型用于广泛的应用,因此它们在全球实验室中经常被大量使用(和共享)。

因此,用于建立这些癌症模型的细胞系可能很快被污染、交叉污染,甚至被错误鉴定。受污染细胞系的患病率估计为20%,最常见的污染物是HeLa细胞,其次是T24膀胱癌细胞。

据预测,每年7亿美元的资金将用于使用受污染或被错误鉴定的细胞系的研究。这些研究增加了得出错误结论的风险,并可能由于研究撤回而损害研究人员的声誉。细胞系和模型的错误鉴定有时也会导致临床前研究的重现性较差。

在建立肿瘤模型之前,研究人员和CRO实施常规检测对培养物进行质量控制,从而验证其身份和质量变得至关重要。虽然多年来一直广泛推荐进行细胞系认证,但污染、交叉污染和错误鉴定仍然是一个严重的问题。

这篇文章回顾了两种最常见的基于基因组的细胞鉴定检测:短串联重复序列(STR)和单核苷酸多态性(SNP)检测,它们的优点和局限性,并审查了身份鉴定的指导原则。

STR或SNP:选择最佳方法

短串联重复序列(STR)检测如何发挥作用?

STR检测采用引物提取重复的DNA片段,通常为2~6个碱基对。STR对于鉴定人类细胞系特别有价值,因为人类群体中每个基因位点的重复次数不同。因此,STR基因分型可以追踪人源性肿瘤的遗传鉴定,包括细胞系来源的或患者来源的异种移植物(PDX)

美国菌种保藏中心(ATCC)发布了 强有力的指导原则,该指导原则制定了人类细胞系鉴定的STR分析标准。

STR检测的局限性

STR检测方法的一个主要局限性是其准确性不高,尤其是用于亲属或具有相近遗传背景的样本时。这意味着STR检测适用于人细胞,不适用于来源于有限品系的近交系实验小鼠的小鼠肿瘤,因此缺乏容易识别个体小鼠肿瘤模型的独特标记物。STR分型也不能区分根据同一人类供体建立的细胞系。

什么是单核苷酸多态性(SNP)检测?

虽然STR传统上被认为是鉴定的金标准,但由于其局限性,目前正在开发改进方法。高通量测序技术的进展导致形成了稳健且成本效益高的SNP阵列分型检测。由于提高了准确性,SNP检测越来越多地用于补充或替代STR鉴定。

SNP检测取决于人群个体中单个DNA核苷酸的自然变异。例如,SNP可以在特定区域用胸腺嘧啶(T)取代核苷酸胞嘧啶(C)。

SNP可以鉴定小鼠细胞系和人类肿瘤模型,与标准STR分型相比具有核心优势。通过STR分型错误分类的错配修复(MMR)缺陷型人细胞系也可使用SNP进行鉴定,检测还可以:

  • 确定性别和种族
  • 检测病毒感染和支原体污染
  • 鉴定常见免疫缺陷小鼠品系。

STR和SNP检测的强度和局限性

本文总结了STR和SNP检测的主要优点和局限性,以供参考。

  优点 局限性
STR

用于鉴定人细胞系

具有已知STR图谱的数据库,可将不同实验室的数据与参考图谱进行比较。DSMZ (莱布尼茨研究院)和ATCC存储库拥有可自由访问的大型在线图谱集合,以查找匹配的图谱。

通常不够准确,尤其是用于具有亲属关系或相近遗传背景的情况时(例如,不适用于鉴定小鼠肿瘤模型)

用于DNA降解水平不同的样本(例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织)时不可靠

无法确定是否存在种间交叉污染,也无法鉴定染色体拷贝数畸变

SNP

用于验证肿瘤模型的高效和稳健的下一代测序(NGS)阵列

适用于小鼠和人肿瘤模型

可用于肿瘤模型采建库和跟踪的质量保证

确定性别和种族,检测病毒感染和支原体污染

缺乏用于识别细胞系的可搜索数据库

用于身份鉴定的匹配概率的阈值是什么?

判读鉴定检测需要匹配标准,以区分“相关”和“不相关”样本。例如,使用基于STR的“Masters算法”或“替代Masters算法”,匹配百分比≥80%的细胞系通常被认为相关(即来源于同一患者或供体),而匹配百分比为55~80%的细胞系需要进一步分型(例如替代检测方法)。

匹配算法基于比较两个细胞系样本之间共享等位基因的数量,以百分比表示。选择已鉴定的样本作为“参考”图谱,而正在进行鉴定的样本是“可疑”图谱。确定两个细胞系之间匹配百分比的匹配算法如下:

匹配百分比=(两个STR图谱中)共有等位基因的数量÷可疑图谱中的等位基因总数(注:纯合子等位基因被视为一个等位基因)

当两个样本被认为相关(匹配百分比≥80%)时,必须记住这两个样本可能来源于

  • 同一细胞系
  • 同一供体的不同细胞系(例如同一供体的不同组织)
  • 相关细胞系(例如子细胞系或姐妹细胞系)或
  • 可能被错误鉴定或交叉污染的细胞系。

由于培养物中的细胞系可能发生遗传变异,这些算法允许一些变异。根据ATCC(ASN-0002标准工作组)已发表的工作,选择≥80%作为合适的阈值。它依赖于来自5个细胞库的相关细胞系样本中的8个核心位点。这些标准允许使用匹配算法成功验证98%的相关细胞系样本。

在少数细胞系中,STR图谱表现出更大程度的不稳定性,导致匹配百分比<80%。ATCC工作组指出,不相关的细胞系通常显示匹配百分比为55%或更低。基于该阈值,匹配百分比低于56%的细胞系被认为不相关,56~80%的细胞系可能无关,但是需要进一步的数据来肯定地确认或驳斥这一结论。

应该多久鉴定一次细胞系?

虽然目前尚无关于细胞系鉴定频率的明确指南,但以下几种情况下需要考虑进行鉴定:

  • 当细胞系来自不可靠的来源时
  • 传代10代后
  • 制备细胞库后
  • 有疑问的时候!

总体而言,最好是经常对细胞系进行鉴定,科学期刊和资助机构越来越多地要求提供这些信息。据推测,对于最近未鉴定的任何细胞系,总是至少存在一些疑问。

结论

由于细胞培养在生物医学研究中的重要性,正确的细胞系鉴定是生成可靠、可重现数据的关键。然而,细胞系污染、交叉污染和错误鉴定仍然是普遍存在的问题,鉴于全球研究实验室产生的细胞系数量不断增加和细胞培养物的高使用率,预计这些问题将进一步扩大。

与鉴定相关的基本质量控制原则存在重大差距,使问题更加严重。严格的例行鉴定过程有助于确保实验室使用的是处于最理想健康状况的正确细胞系。

Topics: Blog, Oncology

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