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HUB organoid: 9大技术问题

2020-03-15

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回顾我们最近的网络研讨会上关于HUB类器官开发的9大技术问题,Hubrecht organoid Technology (HUB)的科学总监Sylvia Boj博士进行了回答。

您能解释一下HUB Organoids是如何产生的吗?

我们的学术小组, Clevers 实验室在多篇出版物中解释了不同组织的HUB类器官的建立,并在之前的一篇博客文章中提到:

除了肠道干细胞,还分离过成体干细胞吗?

我们已经鉴定出Lgr5+细胞在肝脏和胰腺诱导损伤后具有生成新细胞的能力

其他干细胞标记也已被确定,如:

是否可以从冻存组织中生成HUB 类器官?

是的,类器官可以从低温保存的组织中产生。然而,这种方法的效率比使用新鲜组织的效率要低,所以我们只建议使用新鲜切除的组织,而不是冻存的生物样本。

对类器官计数的较好的方法是什么?

我们正在评估市售的一些细胞计数器对类器官计数的效果。目前,我们对类器官细胞悬液进行稀释,然后取10µl稀释后的悬液画一条长线(而不是一滴),数类器官个数进行计数。

HUB类器官如何扩增传代?

通过将类器官分散成小块,可以通过如下方式进行分散:

  • 吹打分散-用低黏附枪头或玻璃管吹吸(玻璃管吹吸仅适用于种在200µl 基质胶中的类器官)。
  • 胰酶消化分散-加入胰酶(胰酶体积为25-50%),吹打分散。

我们推荐后一种方法用于紧实型类器官,紧实型类器官仅靠机械吹打很难分散。重要的一点是:我们并不是用传统的胰酶消化方法(100%的胰酶在水浴锅中孵育)来对类器官进行胰酶消化,这是因为,大部分的类器官模型,如果被消化成单细胞,仅有很少量的可以生长形成新的类器官。

类器官被分散后,离心,用新的ECM重悬。

关于传代扩增-是否评估了不同代次之间类器官的基因特性?您推荐的最高传代次数是什么?

对于从非癌组织生成的正常模型,类器官每周传代一次,已经传代扩增了一年。突变的累积与我们的体细胞的突变累积是类似的 (Huch et al. Cell 2015;(160):299-312; Blokzijl et al. Nature 2016;(7624):260-264)。

对于癌症模型,肿瘤的本质是更多突变的累积或基因组不稳定性的获得。当通过分离肿瘤产生一个新模型或收到一管冻存的类器官后,我们建议先生成一个主细胞库(MCB),然后再生成一个工作细胞库(WCB),复苏WCB的类器官用于实验。

根据类器官模型,每周传代的类器官(如肠、胰腺或肝脏模型)扩增平均需要2-3个月。对于每15-18天传代一次的模型(乳腺或肺模型),扩增需要4-5个月。

随着传代,类器官会有变化吗?

胞外基质胶滴中类器官的密度和生长因子的质量对类器官生长是有很大影响的。如果不频繁更换培养基,类器官铺板太拥挤(拥挤意味着没有足够的信号来维持所有细胞的增殖)或太稀少,类器官细胞就会分化,这样就失去了细胞增殖及其扩增的可能性。

类器官可以低温冻存吗?复苏后可以立即使用吗?

是的,类器官可以低温保存。复苏后,我们建议至少一段时间让它们恢复。但如果实验需要,类器官可以在复苏后立即使用;在这种情况下,重要的是要有一个好的冻融方案,以确保复苏后细胞活力在85%以上。

类器官可以用于芯片技术研究吗?

是的,HUB正在与一些公司合作,在微流控板中使用类器官,而不是使用细胞系。到目前为止,我们已经在肠道和肾脏器官方面取得了一些不错的结果。

如果您有任何进一步的技术问题,请与我们联系。

Topics: Oncology

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