问：如何制备用于高通量筛选（HTS）的类器官？
答: 类器官是在水凝胶/Matrigel 中培养和维持的多细胞结构，需要通过机械剪切将其分割成片段，并以每孔约300个类器官片段（每个结构5-20个细胞）的数量接种。不过，上述数量也可以根据实际情况（类器官的类型以及在实验期间的生长速度）加以调整。
总体而言，将类器官接种到 384 孔板中，然后将被试化合物添加到各孔中并培养 5天。可以选取不同类型的终点读数，比如说，如果您对“肿瘤杀伤”终点感兴趣，那么读数可以选取CTG读数或高内涵成像（HCI）。在冠科生物，我们将冷冻保存的“即用型”类器官与先进的液体处理机器人技术相结合，使用最佳条件下预先建立的特定类型的类器官组合，高效地接种细胞。因此，我们能够每天接种大量孔板，并对多种化合物进行筛选，从而将类器官真正有效地应用于 HTS。
3D 模型中的高内涵成像（HCI）与传统方法和读数相比有何优势？
答: 体外 3D 模型中会发生大量细胞间相互作用，这在传统2D单层培养中是无法实现的，因此3D模型中可供测量的参数更多。HCI和高内涵分析（HCA）能够更深入地考察特定化合物的 3D 生物学和作用机制，借助多重分析设计，可同时监测多种表型和形态终点，例如：
- 细胞核计数、大小、体积、形状
- 坏死和凋亡标志物
- 上皮层的形成和厚度
- 极化和肿胀
- 内化作用
- 细胞周期
- 药物/靶点的亚细胞定位
- （在共培养实验中）监测肿瘤细胞、免疫细胞和成纤维细胞的变化
这些参数均可在不同剂量下进行考察，以生成 IC50 值和曲线下面积（AUC）值。高内涵筛选（HCS）包括基于图像的自动高通量技术和 HCA；在 HCA 中，通过将多参数算法应用于 HCI 数据，可基于单孔分析完整的 z-stack 分析结果（>300种不同形态特征），因而可提供大量有意义的数据，尤其是在与 OMICs 分析相结合时，有助于更好地指导决策。
问：进行生物标志物分析时，需要使用多少细胞系或类器官？
答: 需要牢记的一个关键点是，有效的生物标志物发现必须基于充分的疗效差异，即应答者和非应答者的数量应保持平衡，从而将偏倚风险降至最低。
对于体外细胞系筛选，我们通常建议至少采用10个敏感细胞系和 10个不敏感细胞系，敏感细胞和不敏感细胞之间必须显示出充分的疗效差异，例如 IC50 值相差 10倍。虽然对于一些拥有大量可用模型的癌症类型而言，这一策略是可行的，但对于一些罕见癌症类型或特定亚型而言，要确保产生充分的疗效差异可能比较困难。
与体外或体内筛选相关的外部数据是否可用于生物标志物的发现？
答: 可以。基于任何临床前结果的数据集，只要其样本量足以进行统计检验，均可用于生物标志物的发现。例如，如果您在冠科生物和其他实验室分别测试了若干模型，如果它们具有相似的实验设置，则各个实验数据集可以进行标准化和合并。
哪个数据库可提供胡相互匹配的类器官和 PDX 模型的信息？
答: 冠科生物的 OrganoidBase™ 可提供 PDX 来源类器官（PDXO）和患者来源类器官（PDO）的信息。目前，该数据库包含 400 多个 PDXO，这些 PDXO 都有相对应的体内 PDX 模型，这些模型在冠科生物的 HuBase™ 中列出。客户可以注册以访问上述一个或两个数据库。
模型按癌症类型列出，它们具有相同的识别名称，以便于识别对应匹配的体内模型。OrganoidBase™ 中还列出了配对的患者/PDX 特征，包括体外和体内配对模型之间在基因组、组织学和药理学方面的相关性，这些特征广泛用于药物发现。
问：可以使用类器官进行蛋白质组学研究吗？
答: 当然可以。冠科生物就这一主题发布了一份会议海报。这项研究将肺癌和结直肠癌类器官与等效的体内 PDX 模型进行了比较。具体而言，我们分析了类器官和PDX对靶向药物的治疗应答，并评估了下游靶点通路（如 Ras、EGFR、RET 信号传导）及其对功能蛋白质组和磷酸化蛋白以及激酶富集的影响。
问：如何筛选原代细胞？当原代细胞和类器官都来源患者肿瘤时，类器官有何优势？
答: 原代细胞的处理方式与2D细胞系相似，可用于药物筛选。在一项转录组学分析中，将 PDX、PDXO 和 PDX 衍生细胞系（PDXC）与患者样本和标准 2D 细胞系进行了比较；结果表明，PDX 和 PDXO 与患者样本的相似度高于P DXC，而 2D 细胞系的相似度最低，这主要是由于 2D 细胞系需要适应在塑料表面生长，因而无法完整地显示细胞-细胞或细胞-基质相互作用，而这些相互作用在 3D 环境或体内环境中可以得到清晰的显示。此外，从某些癌症类型中提取原代细胞仍然极具挑战性，在常用培养条件下，通常会选出最能适应体外环境的细胞。
问：冠科生物使用的细胞系和类器官的基因组数据来源于哪里？
答: 对于冠科生物使用的几乎所有细胞系和类器官，包括OmniScreenTM 和 OrganoidXploreTM 组合中的细胞系和类器官，我们已在公司内部进行了全转录组测序和全外显子组测序，以提供有关基因表达、突变状态和DNA拷贝数的信息。对于尚未在公司内部测序的细胞系子集，我们的科学家从“癌症细胞系百科全书 (Cancer Cell Line encyclopedia)” 等数据库中引用了公开可用的表达、突变和拷贝数数据。所有这些数据都可以在我们的可搜索数据库中找到，且这些数据已经过标准化和规范化，以便用于比较。
问：类器官是否会最终取代2D细胞系，还是说2D和3D模型可以互补？
答: 类器官模型的可用范围和数量正在迅速扩展。可提供更多具有高度临床预测性的模型，以供研究人员选择，可用于许多此前依赖于2D细胞系的应用，如 HTS、基因工程和共培养研究等。由于 3D 体外类器官能够更真实地再现复杂的体内环境，类器官模型可以提高癌症药物发现工作的质量和速度，在某些情况下它们很可能会取代细胞系。例如，配对的健康和病变类器官可以进行并排比较（深入了解脱靶效应），这是细胞系无法做到的。
2D 和 3D模型当然可以互补。2D 细胞系通常用于快速生成大型数据集，以用于假设检验，然后可以在类器官等临床相关性更高的 3D 模型中进行进一步实验。
问：在生物标志物的发现方面，类器官等3D模型与 2D 模型有何不同？
答: 与 2D 细胞系模型相比，3D 体外类器官能够更真实地再现复杂的体内环境、患者的基因多样性和药理反应。通过将 3D 类器官与HCI相结合，可以识别更多的表型特征，有助于研究人员确定更多适合作为生物标志物的相关特征，这些生物标志物可用于监测疗效和/或对患者进行分层。
问：在临床上，3D 体外模型是否有助于对患者进行分层？
答: 在早期发现过程中，使用患者来源模型有利于确定生物标志物。在使用多个患者相关模型筛选一系列化合物时，能够生成应答者和非应答者的有价值数据。这些信息有助于确定生物标志物，以区分哪些患者有可能对哪种药物产生最佳应答。
要有效地做到这一点，需要具备必要的基础设施和经验，以实施综合方法。总体而言，您需要筛选足够数量的模型，并辅以必要的生物分析、HCI 和生物信息学，以便获得有意义和可用的数据。这一点对于免疫疗法尤为重要，因为肿瘤和免疫细胞之间的相互作用十分复杂，建模较为困难。因此，可能需要在其他模型系统（如离体患者组织平台 EVPT）中进行额外的优化、验证和量化。
问：在结合 PDO 与免疫微环境对自体T细胞疗法（如 CAR-T）进行评估方面，冠科生物有哪些经验？是否会使用同一供体/患者来制备 CAR-T，并在类器官中重建免疫系统？
答: 我们的标准操作方法是：使用已建立的类器官模型测试非自体T细胞疗法，该模型表达CAR的特定靶点。但是，如果要建立一个自体系统，我们则需要制备新的类器官模型，并使用同一供体/患者来制备CAR-T。另一种备选方法是使用离体组织，在该实验过程中，完整的自体肿瘤微环境仍在原位状态。
问：来源匹配的PDXO和PDO是否具有高相关度？
答: PDXO 和 PDO 与各自组织来源的相关性非常高。我们在学术期刊 《PLOS ONE》发表的文章 中描述了 PDXO 和 PDX 之间的高度相关性。尽管使用患者组织同时制备 PDO 和 PDX（以及随后制备 PDXO）的例子并不多，但在这些例子中，相关性非常高。这并不令人惊讶，因为它们都来源于共同的成体干细胞。我们在学术期刊《Current Protocols》上发表的论文 中提供了一些例子来说明这一点。
问：可以推荐一些用于评估细胞系药物敏感性的数据库吗？
答: 冠科生物的 XenoBaseTM 数据库 可提供多项体外和体内研究中细胞系对药物反应的信息。如需查看所有细胞系的数据，请确保选择位于顶部的体外过滤项。选择后，您可以从可用组合中选择单个细胞系。
问：冠科生物是否会制备供体库，并从中制备单一模型，还是会将这些供体分开保存，然后在筛选过程中以N数量显示？
答: 我们不制备供体库。我们的每个模型都来自于单个患者，并像筛选单个患者一样进行筛选。在单个模型中观察到的任何变异性都可归因于该特定样本/患者内部固有的异质性。因此，通过增加参与筛选的模型数量，您可以捕捉到更广泛的多样性，从而反映出患者群体中存在的异质性。
问：类器官中有多少不同种类的肿瘤微环境细胞？癌症相关成纤维细胞能否用类器官进行研究？
答: 类器官由纯上皮细胞组成，因此类器官培养物中没有TME细胞。不过，类器官可以很容易地与成纤维细胞和/或免疫细胞共培养，以研究不同类型细胞之间的相互作用及其对治疗应答的影响。
问：使用 PDX 进行类器官培养是否存在选择压力？
答: 是的，存在不同的选择压力。当移植到免疫缺陷小鼠体内时，侵袭性强的肿瘤往往更容易成功，而类器官组织培养系统可同时容纳正常组织和肿瘤组织。因此，PDX 来源类器官将代表更具侵袭性的肿瘤特征。此外，在 PDX 模型中，肿瘤微环境（TME）中含有小鼠宿主元素，从而导致人类基质细胞被鼠类基质细胞取代。
问：与动物模型的“传代”过程相比，使用 PDO 有什么优势？
答: PDO 可提供各类不同的肿瘤等级和正常组织。相比之下，患者来源异种移植物类器官（PDXO）可针对每种癌症适应症建立更大的类器官队列，并与来自相同患者的表征良好的体内PDX模型互补。
问：基于患者样本建立类器官培养物的有效率通常是多少？
答: 有效率取决于组织类型，一些类型比其他类型更容易建立；但也取决于特定组织类型的操作经验或培养条件。冠科生物所使用的经授权的HUB方案是基于 Hans Clevers 博士实验室开发的一套原始方案优化而成。这些方案已成功应用于不同类型的组织（包括正常组织和病变组织），并在世界各地的实验室中得到了广泛承认和应用。
问：3D 类器官能否应用于免疫检查点抑制剂 ICI 的研究？
答: 完全可以。将自体免疫细胞与类器官进行共培养，非常适用于免疫检查点抑制剂的研究。我们已经建立了这样的系统来专门评估免疫检查点抑制剂，以避免使用非自体共培养物时可能出现的同种异体反应。但请留意，并非所有模型都有配对的自体免疫细胞，因此在您筹备研究之前，最好先与我们的专家进行沟通。
问：我们的一种化合物在 2D 细胞培养中显示有效，如何在 3D 模型中进行测试？
答: 根据所使用的目标细胞系，我们的科学家将与您共同设计相关的3D培养实验、或选择一个类器官组合来筛选化合物。
问：冠科生物对于类器官使用哪种细胞活力测定法？
答: 我们通常采用 CTG 或 HCI 来测定类器官的细胞活力。
问：我有丰富的肿瘤多细胞球状体 spheroid 应用经验，但现在正在考虑过渡到类器官模型。在我开展研究之前，有哪些研究论文推荐阅读吗？
答: 很高兴您正在探索类器官能如何支持您的研究！Hans Clever 博士实验室有一些经典出版物，很适合作为入门学习资料，我们也推荐您查看我们在PLOS ONE、 Current Protocols 和 JOVE 等期刊上发表的同行评审文章，以及大量学术会议海报、网络视频研讨会和白皮书等，所有这些资料都可以在我们的微信服务账号中轻松找到。
问：是否有可能在类器官内培养毛细血管样结构，以增强营养供应？
答: 虽然我们了解到有研究报告称，在某些体外模型中引入了毛细血管样结构，但我们尚未对此类方案进行过测试。我们的经优化的标准方案（包括扩增和实验工作），可将类器官的最大尺寸保持在 120 µm 左右。这样就避免了较大结构中可能出现的营养/生长因子渗透等问题。一些快速生长的模型和/或固有大型结构一旦超过一定的尺寸限制，就可能会出现生长减缓或核心细胞死亡的情况。由此可见，限制类器官的过度生长、并将其保持为较小结构，是十分重要的。
问：在鉴别应答者和无应答者时，2D 细胞系和 3D 类器官模型输出的结果相似吗？
答: 这取决于药物和模型的靶点/致癌因素。不过，与类器官（和PDX）等患者来源模型不同的是，转录组分析表明，2D细胞系并不是理想的人体相关肿瘤模型，因为其在数次（或多次）传代过程中适应了体外生长条件，对临床应答的预测能力往往较差。
