是否确信您的细胞系和生物模型真的如您所想？您是否了解，常用的基于PCR的细胞系鉴定服务可能无法检测到高达20%的细胞系污染?
在本文中，我们强调了第二代测序（NGS）的价值，它具有更高的灵敏度、准确性和高通量，以及用于细胞系鉴定和污染检测的多功能方法，该方法已被证明优于传统的基于PCR的STR分析。
细胞系鉴定为何如此重要?
生物模型（包括细胞系、类器官、同种和异种移植模型）的错误鉴定和污染仍是鉴定工作中的一项巨大挑战。研究表明，多达33%的流行细胞系受到种内/种间细胞、支原体和/或病毒污染，并且国际细胞系认证委员会（ICLAC）目前已列出了530多个经错误鉴定的细胞系（截至2021年6月），该类细胞系没有已知的真实库存。
使用错误鉴定的细胞系仍然是一个很大的问题，Horbach & Halffman（2017）报告称超32,500篇论文引用了被ICLAC归类为错误鉴定的细胞系数据。
污染仍普遍存在，这可能是由多种来源引起的，包括与其他细胞系和微生物（例如支原体和/或病毒）的交叉污染。
重现性是该科学方法的标志之一，且使用错误鉴别和/或污染的细胞系可能
导致数据不可靠（图1）。因此，跳过鉴定步骤会导致结论不准确、出版物撤回，并且如果发现交叉污染或错误识别导致数据无效，还造成了时间和金钱的浪费。
据估计，由细胞系错误鉴定所导致的无效研究的经济成本超过500亿美元。由此可见，NIH等资助机构和越来越多的出版商要求研究人员提供生物样本鉴定也就不足为奇。
美国FDA还要求，研究用新药（IND）申请中包含的所有材料都要经过验证。
图1.使用细胞系作为肿瘤模型的数据生成场景（The EMBO Journal (2022)41:e111307）
以下是研究人员应该考虑鉴定其生物样本的主要原因：
- 当获得或开发新的生物样本时
- 作为标准的质量控制措施
- 有疑问时
用于细胞系鉴定的基于多重PCR的传统STR分析及其局限性
基于PCR的STR分析使用引物，旨在识别长度为2-6个碱基对的重复DNA片段。由于目标片段在给定人群中有所不同，因此可以生成DNA“指纹”。该技术对于鉴定细胞系和追踪源自患者异种移植或细胞系的人类肿瘤样本特性非常有价值。
根据供应商的不同，STR分析通常只针对9 – 24个位点，同时PCR技术的局限性也限制了细胞系鉴定的灵敏度和准确性。在基因关系密切的情况下，STR分析的准确性可能较低，例如，当试图鉴定源自缺乏独特遗传标记的近交动物特异性菌株的小鼠细胞系或鉴定来自同一人类供体的不同肿瘤细胞谱系时。
此外，已知具有错配修复（MMR）基因突变的细胞系表现出微卫星不稳定性和高突变表型。因此，这会导致遗传漂变和/或污染细胞外生以及STR错误分类。
据称，基于PCR的细胞系鉴定分析的灵敏度在5-10%的范围内，尽管这具有可变性并取决于各种因素，包括受试细胞系的性质和数据的质量，然而，在现实应用中，当污染高达20%时，基于PCR的CLA分析有时无法检出。
采用深度测序技术进行细胞系鉴定
重大的技术进步使得基因组测序成本大幅降低。这包括基于NGS的技术，其可用于高通量和多功能分析，包括大型细胞系生物库鉴定，这些细胞系因交叉污染而臭名昭著。
现已确定，NGS在小鼠和人体样本（包括细胞系、类器官、异种移植和患者组织）的特征分析方面明显优于传统的分析方法。
在冠科生物，我们使用深度第二代测序（NGS），该测序系统具有包含600多个SNP和染色体片段的平台，且以3000x的覆盖率精确地对小鼠和人体样本进行表征。
此外，利用先进的生物信息学和统计建模来支持基于NGS的细胞系鉴定，可同时获得对SNP的识别和频数。可以在单次运行中分析数百个样本，这是对低通量的传统SNP测定的重大改进。
在覆盖率、高通量能力和灵敏度方面，NGS优于仅靶向9-24个位点的用于细胞系鉴定的基于PCR的STR分析。
NGS的另一个优势在于其具有多功能，这是基于PCR的STR分析所不具备的。例如，该NGS方法也可以用于：
- 检测病毒和支原体。
- 确定人类性别和其他人类遗传基因元素。
- 追踪遗传漂变并重建样本系统发育。
- 测定混合样本污染比。
我们已经为最常用的肿瘤研究模型生成了一个SNP指纹库，覆盖了1200多个人癌细胞系和30个小鼠细胞系。
深度测序和基于PCR的STR分析（用于细胞系鉴定）之间的对比见下表：
结论
细胞系鉴定日益重要，资助和监管机构、期刊和科学界均要求研究人员证明其生物样本的可靠性。
基于NGS的SNP分析是一种高通量、多功能和经济有效的细胞系鉴定方法。我司独特的基于NGS的生物样本鉴定平台包含600多个SNP和染色体片段，可精确表征小鼠和人体样本，包括细胞系、类器官、异种移植模型和患者组织。我们还为最常用的肿瘤学研究模型生成了独特的DNA指纹，涵盖1,200多种人类癌症和30种同源细胞系。
欲了解关于如何使用基于NGS的分析来满足您的生物样本鉴定需求的更多内容，请访问我司的细胞系鉴定页面，或立即通过发送电子邮件与我们联系。
