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磷酸化修饰是一种广泛存在的翻译后修饰类型，细胞内有超过 30% 的蛋白质发生磷酸化修饰。它是调节和控制蛋白质活性和功能的最基本、最普遍和最重要的机制之一，参与各种生理和病理过程，调节细胞活动，如细胞增殖、细胞发育、细胞分化和细胞凋亡。

蛋白质磷酸化的同分异构给通过传统质谱法进行的位点鉴定带来了挑战

同一肽段发生磷酸化位点的不同，会造成同分异构的磷酸化肽段， 并在色谱上共洗脱。而传统质谱平台不能对这些共洗脱的同分异构肽段进行分离。据统计，大约至少 26% 的磷酸化肽段存在同分异构的现象，且其中 50% 的同分异构体在色谱上无法做到有效的分离，从而可能会导致出现磷酸化位点鉴定错误的问题。

4D磷酸化蛋白质组学服务的特点

• 固定金属亲和层析（IMAC）策略：使用专有靶向抗体磷酸化肽段，降低样品复杂性。
• 在传统质谱法的基础上增加离子淌度分离，使鉴定更加可靠、检测深度更高。
• 严苛的双重质控，消除低可信度数据：错误发现率（FDR，1%）；错误定位率（FLR，0.75）
• 支持升级版生物信息学分析：激酶预测、信号分析和数据挖掘等

4D磷酸化蛋白质组学的技术优势

磷酸化位点鉴定更高覆盖

4D 技术显著提升了检测深度和灵敏度。

平均鉴定 10,000 个以上高可信度的磷酸化修饰位点（定位概率 > 0.75），相比传统技术提升 50% 以上。

去伪存真，更可靠的修饰鉴定结果

4D 磷酸化蛋白质组学通过额外的离子淌度分离，能够解决翻译后修饰（PTM）同分异构的问题，使得 PTM 的鉴定更加可靠。 

如图所示，很多磷酸化肽段的同分异构体其洗脱时间和质荷比完全一样，但发生磷酸化的位置不同所带来结构上的差别可以通过离子淌度有效的区分。

离子淌度和 HPLC 两个层面的联合分离，能够最大程度地识别和区分这些共洗脱的修饰肽段信号。