您是否想了解肿瘤类器官和离体微肿瘤（即患者肿瘤材料）是如何用于免疫肿瘤学（I/O）的？
您是否有兴趣通过肿瘤类器官和自体及非自体免疫细胞的共培养来评估您的免疫治疗？
或者，您是否想探索体外微肿瘤如何保持肿瘤异质性和保存驻留免疫细胞，从而消除对共培养系统的需求？
在本文中，我们探讨了一个结合3D模型和基于表型高内涵成像（HCI）之分析的平台，以提供药物反应的相关分析，从而为候选药物选择和临床方案设计提供信息。
免疫治疗药物开发面临的挑战
癌症免疫治疗的临床前测试具有挑战性，因为I/O药物需要在相关模型中体现肿瘤和免疫系统之间复杂和动态的相互作用。
当前的体内免疫肿瘤学模型被广泛定义为宿主免疫系统完整的同种移植系统，或将重建的人类免疫系统植入免疫缺陷宿主的人源化系统。然而，这些系统存在一些局限性，可能会模糊与免疫治疗相关的疗效和毒性。例如：
- 物种特异性：尽管同种移植模型具有合格的免疫系统，但其只能用于评估交叉反应药物或替代药物，因此其只能模拟小鼠免疫力（而不是人体免疫力）
- 人源化系统的复杂性导致开发成本高昂，造成时间线紧张，并引起实验时间窗受限的移植物抗宿主病（GvHD）、供体间变异性，以及可能使数据解释复杂化的异体反应。此外，部分或低效的免疫系统重建，会将I/O模型的适用性局限于靶向非重建组分的药物。
在体外模拟免疫治疗反应面临的主要挑战包括：
- 用于在共培养系统中进行测试的患者材料可用性有限
- 自体免疫细胞缺乏抗肿瘤反应性
- 共培养系统缺乏肿瘤微环境（TME）的结构复杂性，以便模拟免疫细胞与肿瘤之间的相互作用。
将类器官共培养物用于I/O应用
肿瘤类器官代表了一个新平台，其可使用患者衍生模型进行体外免疫治疗评估，从而解决其中一些体外和体内缺陷。这些创新性患者衍生3D肿瘤类器官模型可提供临床相关性、群体多样性和患者反应预测性。肿瘤类器官已彻底改变对非I/O药物的评估结果。
肿瘤类器官可与自体或非自体免疫细胞进行共培养，为免疫治疗开发提供与患者相关的体外平台。此外，如后文所述，高内涵技术正用于高通量体外肿瘤类器官和免疫细胞的共培养研究，以测量药物和联合疗法对生理相关形态学特征的影响，例如肿瘤细胞杀伤、生长停滞、侵袭和免疫细胞增殖。
肿瘤类器官和免疫细胞共培养物的优势
将体外肿瘤类器官用于I/O应用的两项主要优势在于，与癌细胞系相比，肿瘤类器官的临床相关性增强，而与人源化体内系统相比，其简单性增强。
多个细胞谱系的3D结构和空间排列导致形成微型器官，这些器官体现了原始肿瘤的基因组、形态学和生理学特征。类器官的可扩展性和生物建库，也能够针对不同患者和癌症类型，轻松筛选出抗人靶点的多种药物及其组合，从而能够更好地体现群体多样性/异质性和应答者/非应答者特征。
与体内平台相比，类器官共培养平台的体外性质也使其具有高度可扩展性，这有助于多种药物筛选，并且可以在使用更复杂的体内模型之前同时对供体/模型组合进行测试。另一项优势在于，还可获得或同时开发出健康的类器官，从而能够并行评价对人体组织的任何潜在脱靶效应，而这在体内模型中是无法实现的。
肿瘤类器官和自体免疫细胞共培养物
自体PBMC和肿瘤类器官共培养物正在积极开发中，这种方法存在一些公认的挑战，包括：
- 供体癌症患者的血容量有限
- 大多数供体患者的PBMC中缺乏肿瘤反应性T细胞
- 药物开发应用的可扩展性有限
肿瘤类器官和非自体免疫细胞共培养物
一种更可行的免疫肿瘤药物开发方法是使用类器官和非自体免疫细胞共培养物，其可克服上述一些挑战。健康供体更容易获得非自体免疫细胞。此处，不是使用匹配的类器官和免疫细胞，而是基于不同的标准选择类器官或免疫细胞。
- 使用冠科生物的“OrganoidBaseTM”，根据目的靶点或突变负荷的基因或蛋白质表达谱来选择类器官
- 可以选择多个非自体免疫细胞供体，或分离不同的免疫细胞，或与HLA匹配
肿瘤类器官和非自体免疫细胞共培养平台用于评估：
- 同种异体T细胞对肿瘤类器官的杀伤作用，以评价免疫治疗药物的效价
- CAR-T和TCR T细胞的肿瘤类器官杀伤作用和肿瘤反应性
- ADCC（NK）和ADCP（巨噬细胞）对肿瘤类器官的杀伤作用
在下述示例中，将两种不同的结直肠癌（CRC）类器官模型与经差异化处理的HLA匹配型PBMC（未经治疗、未经超抗原治疗[SEA]、经SEA预激活、经SEA预激活和再激活）进行共培养。
在将免疫细胞添加至共培养之前，对其进行预标记，并根据不同时间点的类器官肿瘤体积，进行HCI以评估免疫细胞介导的类器官随时间推移的杀伤作用。根据免疫细胞的激活状态和每个类器官模型的免疫原性，观察到差异化杀伤作用。
免疫细胞迁移也可通过跟踪添加至含有肿瘤类器官的水凝胶层顶部的染色免疫细胞来进行追踪。使用HCI和图像分析，在水凝胶内的不同z位置对免疫细胞的数量进行评分，并可以分析其与类器官的距离。
肿瘤类器官和非自体免疫细胞共培养物面临的挑战
肿瘤类器官和非自体免疫细胞共培养物仍面临一些挑战。上述共培养物不能用于检测肿瘤抗原特异性。类器官与非自体T细胞共培养物可测试同种异体T细胞对肿瘤类器官的反应/杀伤作用，并测量免疫检查点抑制剂的效价。然而，在临床环境中，检查点抑制剂旨在改善T细胞对特定肿瘤抗原的反应，而不是诱导同种异体T细胞反应。类器官和非自体免疫细胞平台的进一步开发应允许对肿瘤抗原特异性T细胞的反应性进行测试。
CAR-T细胞共培养物对肿瘤类器官的杀伤作用
采用多种技术研究了CAR-T细胞对肿瘤类器官的杀伤作用，包括ELISA、基于发光的工程类器官分析、形态学分析和FACS分析。下文对三项研究进行了总结，以强调如何使用肿瘤类器官和CAR-T细胞共培养物来研究CAR-T细胞的疗效。
在Crown Bioscience科学家进行的一项研究中，研究人员比较了EpCAM CAR-T细胞对两种肿瘤类器官的影响：胃癌类器官GA0091（EpCAM+）和黑色素瘤类器官ME1154（EpCAM–）。
以不同的效应物：靶点（E:T）比率，将EpCAM CAR-T细胞与两种类器官进行共培养，并在24 h或48 h后采用ELISA对共培养物上清液中细胞因子的产生情况进行分析。ELISA分析表明，EpCAM CAR-T细胞导致EpCAM+ GA0091共培养物上清液中IFN-γ和颗粒酶B的水平显著升高，表明CAR-T细胞对EpCAM+ GA0091胃肿瘤类器官具有有效的反应性（见下图）。
在第二项研究中，对肝肿瘤类器官（PDXO LI6677）进行工程改造以表达荧光素酶和人类CD19，随后与CD19 CAR-T细胞共培养2天。
然后使用基于发光的分析来追踪类器官的生长/死亡情况。研究者报告，荧光素酶活性已成功用于追踪肿瘤类器官的杀伤作用（见下图）。
在第三项研究中，按2:1的比例将肺肿瘤类器官（LU6438 B7H3+）与人B7H3 CAR-T细胞共培养3天。利用经HCI评估的形态学变化以及标记物分析（FACS法），追踪B7H3 CAR-T细胞对B7H3+类器官的杀伤作用。虽然非抗原特异性CAR-T细胞没有杀伤作用，但在第4天采用FACS进行的标记物分析证实了杀伤效果。
总体而言，与癌细胞系相比，肿瘤类器官共培养是更具临床相关性的体外模型，且比体内模型具有更高的可扩展性。使用OrganoidBaseTM可以选择表达特异性肿瘤抗原的肿瘤类器官模型，如上所示，可以使用多种不同的测定方法来评价CAR-T细胞对肿瘤类器官的反应性。
对肿瘤类器官进行工程改造以开发独特的新免疫治疗模型
与体内模型相比，用于I/O应用的肿瘤类器官的另一个显著优势在于，可对其进行工程改造以建立新的免疫治疗模型，例如通过表达所选择的特异性CAR-T靶点。也可对这些模型进行修改以表达荧光素酶或荧光报告基因，从而能够通过成像检测肿瘤类器官的杀伤作用。
3D离体微肿瘤：突出HCI在I/O中作用的病例研究
如上文所述，术语“高内涵”主要是指，可以同时以自动化的方式对单细胞多个形态学参数/特征（使用荧光染料进行测量）进行评价，例如细胞周期状态、细胞和核形态、细胞活性、受体内化和蛋白质聚集等。
这项技术现在正被应用于保留天然肿瘤结构的3D离体微肿瘤（即患者肿瘤材料），以及包含表达重要药物靶点成分的TME，这些成分在肿瘤进展以及对药物反应的调节中均发挥着关键作用。因此，这种方法可提高对I/O候选药物的响应可预测性。
总体而言，该平台成功地证明了离体药物测试方案的实用性，即利用保留TME成分的新鲜患者肿瘤组织以及先进的3D HCI分析来确定药物敏感性。下文第一张图显示出NSCLC患者材料肿瘤体积有所减少、单细胞计数有所增加，以及上清液中IFN-γ有所增加，而第二张图显示出不同药物和离体微肿瘤的药物敏感性热图。
结论
肿瘤类器官无疑已开始弥合组织培养系统与临床患者之间的差距。在免疫肿瘤学应用中使用肿瘤类器官，为研究人员在体外模拟肿瘤的复杂性提供了一个具有吸引力的额外临床前选择，以便进行可扩展的I/O药物开发，包括针对不同癌症类型的药物组合。
虽然使用肿瘤类器官时，通过在一种共培养物中加入不同的细胞类型，就能够对TME进行重建，但3D离体肿瘤培养物包含来自患者的完整TME。
将这些培养系统与基于HCI的分析相结合，便可使研究人员就肿瘤对I/O药物的敏感性进行高度具体的量化。
这些与患者相关的模型可显著改善I/O药物的临床前评价结果，并可能提高临床试验的成功率。
