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高内涵分析在3D类器官成像中的作用

高内涵分析在3D类器官成像中的作用

高内涵分析(HCA)是药物发现和药物验证研究的一种强有力的方法,尤其是当与具有临床高度相关性的3D体外类器官相结合时。结合这些技术,您可以开发全面的细胞特征,即您可了解关于您的化合物将如何影响细胞系统和空间生物学。 

由于技术和下游分析的复杂性,一些研究人员在使用HCA时可能会较为谨慎,在本文中,我们提供了HCA的简要概述,以及我们将如何使用它(与3D类器官结合)以支持各种重要项目。  

高内涵分析是什么?

HCA是指将算法应用于高内涵成像(HCI)数据。HCIHCA的基础,它将自动化显微镜检查和荧光检测相结合,用于细胞进程的多重可视化和分析。当与2D3D体外模型共同使用时,HCI可用于识别靶点上的治疗效果,以及在同一测定中获得关于脱靶效应的见解。 

HCI还可用于3D体外类器官的高通量筛选(HCS有关类器官的更多信息请参阅此处)。HCS和类器官的结合创造了一个具有高度预测性的实证平台,为数据将具有高度可译性提供了最佳机会。随着专为HCIHCS数据定制的HCA算法研发取得进展,将可在复杂的细胞系统中评估更多的特征和终点。

最近的一项研究强调在药物发现中使用类器官生物库及HCIHCA所具有的实用性。通过HCI500多种治疗性双靶向双特异性抗体进行功能性评估,以更好地理解患者来源类器官(PDO)反应的复杂性。这种药物发现策略对一种用于结直肠癌的新型双特异性抗体进行了鉴定。

 

HCA数据捕获

一旦选择了合适的体外模型,则将类器官解冻并将其机械剪切,将类器官片段接种于384孔板上。自动化对于生成、跟踪和分析HCI孔板至关重要。小至大型的液体处理系统(如,Apricot S3, Felix, Tecan Fluent)和机器人(如,PlateButler®)可将大量孔板从培养箱和自动化HCI仪器中移入和移出。如下图所示,通过利用现成的冷冻类器官和液体处理机器人来进行接种,并将类器官暴露于化合物,每日均可产生许多孔板。 

高内涵成像和分析工作流程。

在仪器方面,可以使用宽视场或共聚焦显微镜(如,Molecular Devices ImageXpress Micro XLSImageXpress Micro Confocal)进行HCI捕获,因为使用共聚焦可提供更好的图像和空间分辨率,但成本将增加。4x物镜非常适用于标准测定(全孔),而20x物镜则适用于结合/内化和MoA测定。

由于类器官为复杂的3D结构(直径在100 μm500 μm之间),因此,z-stack成像是获得样本的准确表征所必需的。这种技术通过结构捕获多个切片,然后对每个堆栈进行分析,以捕获3D结构的焦内信息。

根据类器官的数量和大小、所需的荧光通道(通常多达4个),以及成像板的总数,将产生大量的数据,因此在进行HCA实验时必须考虑存储方案。

 

HCA读数和结果

图像质量是HCA成功与否的关键,同时也是数据可靠与否的关键。HCA采取专有的3D平台进行图像分析和可视化。标准测定的初始读数包括来自每个荧光通道的原始强度热图(见下文),然后对可能对下游分析和解释产生负面影响的图像伪影进行彻底的质量检查。 

使用专有的3D平台对标准测定进行高内涵成像处理和分析。图像分析流程分析后的数据证实了热图的初步结果。 

与固定终点测定(如Cell-Titre Glow[CTG]发光法或细胞核计数法)相比,HCA显著扩展了由细胞测定获得的信息量。 

例如,HCA的细胞核计数包括每孔每个模型的300+个数据点,这为我们提供了大量的额外生物信息,有助于深入了解特定化合物的机制。使用HCA可以获得的表型和形态测量包括:

  • 类器官和细胞核:计数、大小、体积、形状
  • 上皮细胞的构成和厚度
  • 侵袭特性
  • 坏死和凋亡标记物
  • 极性
  • 肿胀
  • 细胞周期
  • 内化
  • 治疗/靶点定位
  • IC50,曲线下面积(AUC

这些读数可从单一或广泛选择的类器官模型中针对少量化合物进行测试的标准测定中收集。通过选择不同的模型,对1000种不同浓度的化合物进行大规模筛选也存在可能。

 

数据分析

HCA大大减少了与人工图像分析相关的时间负担和偏差,但使用HCA确实需要在工作流程中实现准确且经过验证的算法。此外,虽然HCA在很大程度上是自动化的,但有时通常需要人工审查,以确保算法按照预期执行。 

以下是HCA的关键步骤:

  • 图像阈值生成图像掩膜,其可从背景中区分信号
  • 分割以定义单独的对象/类器官、细胞边界和亚细胞结构(如,细胞核)
  • 特征提取(例如荧光强度、腔宽、类器官大小等)
  • 治疗水平数据分析

类器官模型具有不同的形态,所以算法具有准确地捕获这种多样性的能力至关重要。这可通过利用灵活的工具来完成,其中每种形态都具有特定的图像分析工作流程,见以下示例。 


来自不同肿瘤类型(胰腺、肺、卵巢、结直肠、黑色素瘤)的代表性类器官3D图像。

尽管HCA研究的大多数类器官来自人或小鼠肿瘤,但值得注意的是,其他类型的细胞也适合于3D培养。 

例如,髓样细胞的3D培养已被证明体现了于体内观察到的形态学特征。通过我们内部开发的软件进行图像分析,成功地鉴别了不同髓样细胞群最显著的表型特征。

随后,使用选定的特征(如形状、大小和尖度)对分类器(即自动将数据分为一类或多类的算法)进行训练,为每个细胞群创建可用于评估细胞极化的准确的表现型图谱。 

人或小鼠多囊肾细胞的3D培养也成为了多囊肾疾病(PKD)建模的标准,而PKD是一种在肾脏中发育成簇囊肿,导致功能丧失的疾病。囊肿形成可以经3D可靠再现,且HCA已成功用于测量和了解在体外环境下肿胀的性质。

HCA还可以在单次测定中捕获额外的形态学特征,如膜结合与细胞内特征,并且多达两个标记物可在FITCCy5通道中结合。此方法已被用于有效地量化标记物表达或抗体定位和摄取(见以下示例)。

用四种荧光标记的HCA来量化抗体在类器官中的定位和摄取。

HCA不限于单一培养类器官研究。复杂的3D共培养目前通常被用于在包含免疫细胞、肿瘤细胞和微环境的实验系统中评估免疫治疗的疗效。 

 

结论

在过去的几年中,HCIHCA技术已非常成熟,它们目前被用于支持药物发现和药物验证工作。在大型筛选研究中,通过将HCIHCA与临床相关的3D体外类器官相结合,研究人员可以在了解关于化合物如何影响复杂的细胞系统和空间生物学的背景下开发更完整的细胞特征。 

将这些技术进行结合,需要掌握技艺精湛的科学家们所具备的专业知识,从而对合适的工具进行部署。如果您对您的研究项目如何从HCI和肿瘤类器官的结合中获益存有疑问,请联系我们,以与我们的科学家进行交流。