药物开发失败率仍然很高，这部分归因于当前临床前研究结果与人体相关性差。需要对患者应答具有更高预测力的模型。
在本文中，我们探讨了如何利用 3D 体外模型（例如，类器官、在3D中生长的细胞系和离体患者组织（EVPT））来制定有效的给药策略（包括单药或多药联用），这些模型更准确地模拟了复杂的体内环境，可用于做出更好的决策。
为何使用 3D 体外模型进行药物筛选研究？
为了克服目前临床前数据可转化性差的问题，迫切需要在药物发现的最初阶段（即，高通量药物筛选 [HTS]）构建更先进的临床前模型，以便更好地模拟人类疾病的复杂性，从而在药物发现早期做出更好的决策。前不久，技术进步导致了传统 2D 单层培养系统替代品的出现，例如 3D 体外类器官和 EVPT 平台，它们更准确地模拟了复杂的体内环境，从而显示出对患者应答的高预测力。
此外，使用先进的 3D 体外模型有可能彻底改变传统的药物筛选工作流程，该流程通常是先识别先导化合物，然后作为单独的步骤，以识别目标患者人群。通过使用矩阵HTS工作流程，可以同时使用多个患者相关模型来反映个体患者层面和整个患者群体层面的患者特征（即，患者相关模型捕获在患者人群中观察到的异质性）。
由于可以在一组患者相关模型上同时筛选化合物，因此，在选择使用哪种先导化合物进行研究时可以更快地做出决策。矩阵HTS方法实际上是在培养皿中进行的临床试验，代表了早期药物发现的革命性方法。这种高通量方法现在可以与高内涵成像（HCI）和高内涵分析（HCA）技术相结合，以开发化合物如何影响细胞系统和空间生物学的综合细胞谱。
3D 中的联合用药策略
有效联合用药的识别和转化仍然具有挑战性，特别是由于在评估和量化联合用药效应方面出现了困难。现在可使用组合筛选来评估多种类型的 3D 体外模型的多药联用策略。有关联合用药研究的研究设计选项的其他信息，参阅我们之前的博文。简而言之，虽然矩阵设计最复杂，但与更简单的设计相比，该设计生成了高度全面的数据，包括在更广泛的比率范围内有关药物相互作用和剂量的信息。图1显示了一个组合板图，其中在 6×6 矩阵中联合使用多个剂量，以评估药物在多剂量比下的相互作用。
图1：组合板图（6×6矩阵）
可以使用诸如 CrownSyn™ 冠科生物自主开发的用于 HTS 联合用药分析的服务）等生物信息学来评估和量化两药联用效应（协同、拮抗和加性）。此类分析可以在进行下游步骤之前确定最佳的体内联合给药方式。图2显示了协同分析中Bliss独立模型的热图和曲面图，该模型评估彼此独立但相互竞争的单药在联用中的效应。该信息可以确定药物A导致的细胞死亡概率在统计学上是否独立于药物B导致的细胞死亡概率。
图2：CrownSyn – 协同分析中 Bliss 独立模型的热图和曲面图
矩阵设计可用于评估多个 3D 体外模型（例如肿瘤类器官）的多种组合策略。图3显示了通过两种不同的方法（Bliss 和 Loewe）分析所得的MK 1775 与 MK 8776 联用治疗胰腺癌（PA5389B）类器官模型的结果。数据显示低浓度下的强协同作用，其中协同评分表示为 2D 等高线图、3D 响应曲面图、评分和剂量抑制热图。
图3：通过两种不同的方法（Bliss 和 Loewe）分析所得的 MK 1775 与 MK 8776 联用结果
患者来源囊性纤维化（CF）类器官的体外多药联用筛选试验
在本节中，我们描述了采用冠科生物的毛喉素诱导肿胀试验来测试最近批准的三联疗法（TRIKAFTA®）（由校正剂 VX445（elexacaftor）、VX661（tezacaftor）和增强剂 VX770（ivacaftor）组成）对患者来源囊性纤维化（CF）类器官（表示为 F508del/del）的影响的结果。
将 CF F508del/del 类器官以 3D 方式接种在 384 孔板中，并暴露于单个 CFTR 调节剂或组合中。添加毛喉素以诱导肿胀反应。使用3D专有图像分析软件对类器官进行量化。图 4A 显示了 TRIKAFTA 不同成分的个体剂量效应曲线。所有化合物的管腔面积均有所增加，VX445（橙色）的效果最强。选择单剂量并进行组合测试，其数据如图4B所示。在添加不同类型的 CFTR 调节剂后，可以测量不同的效应大小；当添加完整的 TRIKAFTA 混合物（最右侧蓝绿色条）时，观察到的增幅最大。
图4：与溶剂对照（0.2% DMSO）和仅兴奋剂对照（毛喉素）相比，经 CFTR 调节剂处理后的量化管腔面积数据表示为管腔和类器官面积之间的比值（平均值，N = 4）。
溶剂对照（未处理，左）和 TRIKAFTA 处理（右）的代表性图像如图5所示。在两种条件下，均使用毛喉素刺激 3 h，随后进行固定、染色并分析。荧光图像（左下）显示细胞核为蓝色，F-肌动蛋白为红色。掩模图像（右上）显示量化类器官（绿色）和管腔（红色）的轮廓。如果未经处理，类器官在受到毛喉素刺激后几乎没有可量化的管腔膨胀。如图所示，在经 TRIKAFTA 处理后，类器官能够膨胀并呈现清晰的管腔。
图5：经培养的 3D CF F508del/del 类器官中的 3D 图像分析
通过 HCI 和 HCA，可对表型变化进行可靠的量化，从而能够进行准确的反应矩阵测量，如将 VX445、VX661 和 VX770 以 8×6×4 矩阵的形式结合到经培养的 3D CF F508del/del 类器官中（图6）。
图6：3D 图像分析可对表型变化进行可靠的量化数据表示为管腔和类器官面积之间的比值（平均值，N = 4）。
使用细胞系进行甲基纤维素和软琼脂试验的 3D 体外模型
冠科生物已验证一系列用于 3D 试验的市售体外细胞系。简而言之，细胞在甲基纤维素、软琼脂或其他市售基质上以适当的稀释度生长、收获和接种，以达到针对各细胞系优化的最终密度。图7显示了头颈癌细胞系 FaDu 的剂量效应曲线，FaDu 在 3D 中生长，并用递增剂量的实验性抗癌化合物进行处理。从第2天开始，根据浓度设计对每个孔给予抗癌化合物，并且每天监测细胞生长，直至终点，此时使用 CellTiter-Glo®（CTG）试验计数细胞数量。
图7：FaDu 头颈癌细胞系的剂量效应曲线
也可使用低贴壁 96 孔板中的软琼脂试验。例如，将细胞系以 3×10³ 个细胞/孔铺板于 0.4% 琼脂中，覆盖 0.6% 琼脂的基层。向生长培养基中加入供试品，终点为 CTG 或成像试验。图8显示了上述两个终点顺铂剂量效应的比较图像。计算的 EC50 值具有可比性，验证了 HCI 作为本试验的终点。
图8：通过 CTG 和 HCI 使用顺铂处理 CFPAC-1 癌细胞系的剂量效应曲线
使用 HuPrime® PDX 模型和 PrimePanelTM 细胞的 3D 肿瘤生长测定（TGA）离体模型
通过使用高度表征的 PDX 模型，如冠科生物的 HuPrime PDX 模型，研究人员可以通过使用临床相关体内药物疗效模型，结合适用于高通量体外药物筛选的 3D 体外/离体甲基纤维素测定法获得益处（示例图，见图9）。
图9：描述如何使用从高度验证的 HuPrime PDX 模型中新鲜分离的细胞进行离体克隆形成试验
所有 PDX 来源离体模型均可用于本试验。例如，对于接种到免疫缺陷小鼠中的新鲜分离的原代细胞，收获异种移植物。裂解肿瘤，并将细胞接种于甲基纤维素或 3D Alvetex®
以下是对从胆囊肿瘤模型 GL0440 中新鲜分离的原代细胞进行的离体药效研究示例。给予不同浓度的顺铂并为每一剂量拍摄图像。
图10：顺铂对 3D 培养 GL0440 原代细胞的离体疗效研究
在另一个示例中，图11显示了甲基纤维素试验中使用从 OV5397 卵巢癌 PDX 模型中新鲜分离的细胞对顺铂的剂量效应曲线。
图11：顺铂对 3D 培养 OV5397 原代细胞作用的剂量效应曲线
使用离体患者组织（EVPT）平台使肿瘤模型更贴近临床情况
离体患者组织（EVPT）药代培养平台使研究人员能够在保存的包含内源性免疫细胞、成纤维细胞和其他基质成分的自然肿瘤微环境（TME）条件下，评估抗癌药物在患者肿瘤中的作用。通过使用以 384 孔形式直接接种的 50-300 个患者肿瘤组织，EVPT 平台是一个与患者高度相关的转化系统，可以更好地模拟人源肿瘤的异质性和分子/基因复杂性。这有助于在决定是否推进肿瘤学或免疫肿瘤学治疗候选药物时做出更好的决策。
通过自动化 3D 表型 HCI 和 HCA 测量药物效应，包括肿瘤杀伤和免疫细胞增殖，以便在高通量中对单一和联合治疗进行稳健评估。图12描述了测定原理。还可以使用流式细胞术、IHC、细胞因子分析和第二代测序进行其他分析。
图12：EVPT 测定原理
下图显示了使用 EVPT 平台（卵巢肿瘤组织）对各种化疗药物的浓度依赖性肿瘤杀伤应答情况。
图13：使用 EVPT 平台（卵巢肿瘤组织）测试各种剂量的肿瘤治疗物
图14显示了作为不同免疫治疗方案（单药和联合用药）治疗功能的肿瘤类器官总面积的读取结果。
图14：免疫疗法应答及表型读数
结论
3D 体外模型，例如本文中描述的模型，提供了与患者高度相关的模型，其适用于高通量药物筛选，以识别有效的给药策略。由于上述3D模型更准确地模拟了复杂的体内环境，因此在制定给药策略（包括单药或多药联用）时可以做出更好的决策。通过将3D体外研究与 HCI 和 HCA相结合，研究人员能够更深入地了解化合物的体外效应，同时忠实地模拟体内环境，最终更准确地预测体内药物反应。
