中美冠科的免疫肿瘤学高级总监Huang Yujun博士在其近期主持的类器官与免疫细胞共培养网络研讨会上就大家最关切的问题进行了解答，内容包括如何研究肿瘤抗原特异性免疫细胞的反应性和肿瘤类器官共培养平台的最佳应用。
类器官与免疫细胞共培养的应用
如何设置CAR-T特异性杀伤的对照物？
我们开展的一项案例研究表明，可使用靶阴性类器官作为对照物。我们使用EpCAM阴性黑色素瘤类器官作为EpCAM CAR-T的对照物，并提供CAR-T对EpCAM+类器官的反应性。您可以使用我们的类器官数据库和交互式模型列表来搜索相关模型，将其用作对照物。
是否能够平行研究化合物的安全性与使用类器官的有效性？
是的，我们的一些源自健康组织的类器官可与肺部、结肠直肠和胰腺等肿瘤相匹配，并可用于寻求靶向/脱靶效应。
异体巨噬细胞在抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）检测中是否起作用？该项检测是否需要使用自体巨噬细胞？
是的，异体巨噬细胞在ADCP中的作用与在传统细胞系ADCP检测中的作用类似。
类器官是否包含成纤维细胞和肿瘤细胞等基质细胞群？生成仅包含肿瘤细胞的类器官时，肿瘤细胞是否是从人类样本中分离得出？
并非如此，我们的类器官并不含基质细胞。我们的类器官技术仅选择性地扩增肿瘤细胞。肿瘤细胞可以不断更新，以便用于更大规模的临床前检测。
类器官与免疫细胞共培养的技术问题
是否加入rIL-2来激活具有抗CD3/CD28抗体的PBMC？
刺激抗CD3/CD28抗体时，无需使用RIL-2进行体外激活。无论是否存在IL-2，均有可能激活T细胞，因为T细胞在短期培养中会产生IL-2。
测定活细胞/死细胞和经CFSE标记细胞时，是否能够区分肿瘤细胞死亡与T细胞死亡？
由于肿瘤类器官的标记使用的是CFSE，而不是T细胞，因此我们通过CFSE来区分活细胞/死细胞。
此项检测是否在含有Matrigel的悬液中进行？将肿瘤包封于3D培养基质中的这一做法对T细胞来说是否存在任何限制？ 如何将此类检测结果与患者联系起来？
在典型的共培养中，在较低浓度的Matrigel中混合类器官和T细胞。在这些条件下，T细胞能够进入肿瘤类器官细胞。在培养基中，T细胞存在于凝胶顶部，而类器官存在于较高浓度Matrigel的底部，因此采用了不同的设置来评价T细胞浸润情况。也就是说，我们的共培养系统无法完全重现患者的肿瘤微环境。患者肿瘤微环境中的其他因素也可能会影响药物的有效性。
将流式细胞术应用于类器官共培养是一项艰巨的工作。是否存在一种将类器官从Matrigel中分离出来的特定方法？
我们结合了机械和酶解方法，从培养基中分离出类器官。
在未进行IFN-γ孵育的情况下，PDO是否会表达PD-L1？ 这一表达是否具有细胞系依赖性？
即使未进行IFN-γ刺激，一些类器官仍然会组成性地表达PD-L1，并且这一表达具有细胞系依赖性。我们可以通过核糖核酸测序（RNA-seq）和流式细胞术来分析PD-L1表达。在此项案例研究中，我们发现在针对该特定模型使用IFN-g进行孵育时，PDL-1表达有所增加
类器官和非自体PBMC的共培养使用了哪些商业抗PD-1抗体？浓度是多少？另外，在使用非自体患者PBMC进行类器官共培养时，在肿瘤特异性识别方面具有哪些相关经验？
我们使用了BMS和Merck抗PD-1抗体作为体外封锁检测的基准抗体。通常使用的浓度为10-20 ug/mL。我们尚未在非自体患者中进行肿瘤特异性识别检测。
是否会提供患者源类器官的治疗反应等临床信息？
是的，我们的大部分类器官均提供癌症分期和类型等信息。但是，这些类器官均源自于初治患者的手术切除。
尤其是在对不同类型的免疫细胞进行混合时，是否需要使用不同的模型来改变培养基条件？
由于对不同干细胞的要求不同，因此不同模型的培养基条件也不同。这也取决于培养的持续时间。
如何控制样本间差异？
令人惊讶的是，采用传统有效性检测与采用免疫细胞共培养检测的样本间差异极小。
正在开发的类器官与免疫细胞共培养检测
既然目前的检测不使用自体PBMC，那么这些检测是否能够评价抗原特异性T细胞在类器官共培养中的反应性？
是的，我们正在开发用于评价抗原特异性T细胞在共培养中反应性的检测。我们使用CMV血清阳性供体的CMVpp65特异性T细胞与HLA-A2阳性类器官进行共培养，并在共培养中对CMV特异性T细胞的应答进行检测。
是否能够测定免疫细胞对肿瘤类器官的浸润情况？
由于近期我们收购了OcellO B.V.，现在我们能够使用类器官和高内涵成像来评价T细胞浸润以及癌症免疫周期的各个方面，可测定500多种不同的形态参数。
是否会提供用于评价巨噬细胞和MDSC等以骨髓细胞为靶点药物的类器官共培养检测？
我们正在开发巨噬细胞/类器官共培养检测，在这方面我们拥有非常有价值的数据。目前，我们正在开发多种ADCP检测，对巨噬细胞复极化检测的开发也已接近尾声。
是否会对Incucyte和其他系统等实时成像分析进行评估？如是，是否无需使用由荧光素酶转导的单细胞悬液或进行单个时间点分析？
是的，我们正在研究实时成像，以便监测凋亡信号传导对肿瘤类器官杀伤的影响。
是否能够使用TIL来代替PBMC？
我们正在开发使用自体TIL进行的共培养检测。由于用于大规模研究的TIL样本有限，因此我们正在研究如何扩充这些样本。与PBMC相比，TIL中存在更多的肿瘤特异性T细胞。在一般情况下，这些T细胞的灵敏度更高。
