在本文中，我们将探讨通过体外筛选来识别生物标志物的原因和途径。我们还将介绍一项病例研究，用于强调通过体外筛选来开发药物反应生物标志物特征的确切途径。

生物标志物在药物开发过程中的价值

鉴于许多疾病均为异质性疾病，个体患者对相同治疗的反应往往大相径庭也就不足为奇了。

多项研究表明，与那些在患者选择过程中未采用生物标志物策略的临床试验相比，采用了生物标志物策略的临床试验往往更成功。

近年来，生物标志物的使用取得了较大进展，尤其是在肿瘤学方面，例如FDA批准基于特定肿瘤生物标志物（而非肿瘤位置或肿瘤起源部位）使用帕博利珠单抗（Keytruda^®，Merck）和拉罗替尼（Vitrakvi^®，Bayer）治疗癌症患者。

由于临床试验的失败率持续走高，特别是在肿瘤学领域，因此仍然迫切地需要通过识别预测性生物标志物来对患者进行分层，以便提高疗效，同时增加患者安全性。

在药物开发过程的早期识别出生物标志物，有助于建立一个由生物标志物引导的可靠方法，在早期阶段识别出最有前景的候选疗法，并为特定的患者人群和适应症定制新疗法。

通过体外筛选识别生物标志物的原因和途径

体外筛选研究提供了一种用于识别生物标志物的高通量方法。这种方法通常使用可靠的生物信息学和验证策略，并且能够利用从传统的2D细胞系到3D类器官模型不等的一系列细胞类型（如肿瘤类器官）。

肿瘤类器官的功能尤为强大。鉴于采用可靠的HUB方案建立肿瘤类器官时，这些肿瘤类器官已被证明能真实地再现其亲代肿瘤的基因组、形态和病理生理特性，为识别生物标志物提供高度临床相关的3D体外肿瘤模型。

此外，通过利用先前建立的患者相关肿瘤类器官生物库，能够通过体外途径表现出存在于真实世界患者人群中的异质性/多样性，如癌症亚型和遗传特征。例如，当涉及到识别患者药物反应的生物标志物时，这是一种功能强大的方法。

高通量的体外生物标志物识别方法首先生成基线细胞图谱（如基因组和/或蛋白质组图谱），使用研究药物对其进行治疗，然后分析和比较应答者与非应答者样本的图谱，或采用生物信息学方法将基因组图谱与体外疗效读数相关联，从而获得数量充足的细胞或类器官模型。

最后，新识别出的预测性生物标志物可被用于指导下游决策，例如选择适当的体外和/或体内模型来进行验证或新靶点和假设检验，如下图所示。

以下病例研究强调了通过体外筛选研究来有效地识别反应的生物标志物特征。

通过体外筛选病例研究发现生物标志物

伊立替康是一种拓扑异构酶I（TOP1）抑制剂，主要用于治疗结肠和直肠癌。从机制上来说，伊立替康和其他TOP1抑制剂被认为是通过以下途径发挥作用：在细胞周期的S阶段开始破坏复制叉，导致DNA合成受阻，细胞周期阻滞，最终导致细胞死亡。

一项体外筛选研究使用伊立替康对300个细胞系进行了组合检测，目的是识别出新预测性生物标志物。

下图显示了基于来源组织获得的细胞系曲线下面积（AUC）数据。

使用从体外筛选中获得的大量疗效和效价数据，依据伊立替康敏感性将细胞系分为三组（即不敏感组、中度敏感组和敏感组）。如下图所示。

随后，通过主成分分析（PCA）对所有细胞系的整体基因表达数据进行了评估，以识别出潜在的“自然”群组聚类。

通过生物过程的基因本体（GO）进行的功能分析表明，DNA复制在应答者与非应答者之间的表达差异最大（参见下图）。

这一结果与拟议的伊立替康作用机制高度一致，并且突显了体外筛选在识别和验证相关化合物MoA方面的价值。

体内验证

随后，通过小鼠临床试验（MCT）进行了一项下游体内验证研究。该研究涉及16个独特的PDX模型，每个PDX均在每个治疗组和溶媒组的3至10只小鼠中建立。

通过使用线性混合模型（LMM）框架以及采用基于分类终点的方法（即RECIST[实体肿瘤反应评价标准]和TGI[肿瘤生长抑制]），评价了伊立替康疗效的基因组相关性。

生物信息学分析显示，对于参与DNA复制开始和细胞周期通路的基因，排名靠前的基因高度富集，这与体外细胞筛选结果一致。

这些数据还证明选择一种先进数学方法的重要性，如线性混合模型（LMM），以便确定遗传相关性。因为这种方法可以直接模拟基因对肿瘤生长的影响，从而拟合疗效数据。

有趣的是，SLFN11被识别为一种伊立替康敏感性的单基因表达生物标志物。SLFN11是一种推定的DNA/RNA解旋酶，已被证明能够不可逆地阻止正在经历复制压力的细胞中的复制。高SLFN11表达的细胞也被证明更容易受到DNA靶向药物的影响（例如，参见此处、此处和此处）。

但是，研究人员必须考虑到，单一生物标志物策略可能并不总是能够实现。在许多情况下，考虑到许多疾病的复杂性（如癌症），使用单一生物标志物的效果可能并不理想。

技术的进步使同时测量多个参数成为可能。这种方法目前在构建复合生物标志物方面处于领先地位，能够更详细地展现生物系统的全貌。

在本研究中，通过使用一组21个基因，达到了伊立替康敏感性的最高预测准确度。

尽管复合生物标志物组合检测会增加复杂性，但关键是一旦建立候选基因特征，将会执行下游验证步骤。

正如下图所示，与单基因（SLFN11）表达相比，在所有细胞系中（包括“中度”敏感组），AUC与特征分数之间的相关性明显高于AUC。

为了总结病例研究：

• 在一项大型癌细胞系组合检测中评价了伊立替康的疗效，以便探索其机制，并在实体瘤中发现生物标志物。
• 一种用于机制研究的生物信息学驱动方法表明，GO分析和通路分析的结果确认，DNA复制与疗效相关。
• 尽管SLFN11表达是最强的单基因生物标志物，但基于表达的21基因复合生物标志物能够达到更高的疗效预测准确度。

下文中的流程图提供了一个高度综合的体外生物标志物发现工作流程，以供参考。

结论

在药物开发过程的早期，利用体外筛选方法进行生物标志物识别是一种用于并入生物标志物策略的较好方法。

不同于传统的筛选研究，使用的是生长的细胞系作为单层细胞。3D模型（如肿瘤类器官）正被越来越多地使用，因为这些模型已被证明具有高度的临床相关性。

正如上述病例研究所示，单基因生物标志物可能很有用，但是现有的技术尚处于实现有效地生成具有更高准确度的复合生物标志物的开发中。

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